茉莉酸甲酯对马尾松萜类合成酶活性及其细胞化学定位的影响

姚瑞玲　李慧娟　张晓宁　王胤

摘要： 马尾松（Pinus massoniana）是我国南方生态建设与造林用材的主要树种，为了揭示马尾松抗虫机理尤其是诱导抗虫性的分子机制，该研究以马尾松幼苗为材料，通过外源喷施茉利酸甲酯（MeJA），分析了处理与对照间植株针叶显微结构、萜类合成酶活性及其细胞化学定位的变化。结果表明：在0.2 mmol·L-1 MeJA处理下马尾松植株松针中萜类物质，尤其是单萜、二萜的相对含量增加，马尾松毛虫拒食性明显，诱导抗性增强。显微观测中，针叶叶肉细胞内树脂道分泌物增加，叶绿体数目减少，但叶绿体体积增大，叶绿体片层结构增加。MeJA处理4周后，针叶中萜类合成酶活性增加，通过电镜酶细胞化学观察，膜系统尤其是叶绿体膜上萜类合成酶活性定位明显增强。这说明MeJA诱导的马尾松诱导抗性可能与改变的叶绿体结构及绿色质体萜类合成酶活性密切相关。

关键词： 马尾松， 诱导抗性， 细胞化学， 萜类物质

中图分類号： S722.8文献标识码： A文章编号： 1000-3142（2018）07-0876-10

Abstract： Pinus massoniana is one of the most important tree species for afforestation in South China， and it is of great economic value and ecological benefit. This study aimed to reveal the cytological basis in relation to induced resistance during the biosynthesis of terpenoids in P. massoniana， and provide the guide for the further research on molecular mechanism of induced insect resistance in P. massoniana. In the illumination incubator with strictly controlled conditions of light and temperature， variations of microscopic structure， terpenoid synthetase activity and its cytochemical localization of needles were investigated in P. massoniana seedlings treated by exogenous jasmonates. The results showed that there were increases in the relative contents of terpenoids， especially， in those of monoterpenoids and diterpenoids， and the antifeedant of Dendrolimus punctatus against needles in Pinus massoniana seedlings was increased following the treatment of 0.2 mmol·L-1 MeJA， which indicated that the induced resistance of P. massoniana were strengthened. For the variations of anatomical structure， secretions of resin canal were enhanced， the number of chloroplast was reduced， the volume of it was increased， and the thylakoid of it was enhanced in the needles of P. massoniana seedlings. The activity of terpenoid synthetase was increased after four weeks of MeJA treatment. The localization of terpenoid synthetase activity was remarkably increased from membrane system， especially， from chloroplast membrane in the needles of P. massoniana seedlings using the method for electron microscopic cytochemistry of enzyme. This implies that the induced resistance is closely related to the changed chloroplast structure and terpenoid synthetase activity in green plastids in P. massaniana exposed to MeJA treatment.

Key words： Pinus massoniana， induced resistance， cytochemistry， terpenoid

马尾松（Pinus massoniana）是我国造林用材与生态建设的主要造林树种，人工林面积达1 200万hm2，居全国乔木树种的首位，其利用价值高，生态、经济与社会效益显著，具有广阔的推广应用前景（丁贵杰等，2006）。马尾松虫害严重，发生面积最大，在我国周期性暴发成灾，制约了马尾松产业的高效发展（戈峰等，2002）。目前，利用马尾松组成抗性通过良种选育在虫害防治方面取得了显著成效，但在马尾松诱导抗性方面的报道仍鲜少见，其抗虫机制仍不清楚（胡少波等，1988；马尾松抗松毛虫抗性研究组，1990；孙艳丽，2010）。在马尾松的诱导抗性机理研究中，许多学者发现马尾松抗虫性与萜类物质有关（胡少波等，1988；胡永建，2010）。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate， MeJA）属茉莉酸类物质，其广泛地存在于植物体中，化学起源于膜脂，由α-亚麻酸经系列酶促反应生成（Creelman & Mullet， 1997）。众多研究表明，MeJA对植物有广泛的生理效应，在代谢和生理功能上具有植物激素的特点（Fldt et al， 2003； Mithfer & Boland， 2012）。MeJA作为内源信号分子不仅调节植物的生长发育，而且通过外源应用能够诱导植物对机械伤害、病虫害、干旱、盐渍和低温等逆境的防御反应（张秋菊等，2012；Hung & Kao， 2004； Ananieva et al， 2007）。研究证明，外源施用MeJA可显著增加植物内源萜类次生代谢物质的合成，植株抗虫性增强（胡永建，2010；冯宏祖等，2013）。王立春等（2008）发现，通过喷洒MeJA于马尾松植株上，针叶中萜类物质含量增加，抗虫性增强。萜类物质种类繁多，在不同的细胞场所形成不同的萜类化合物（王凌健等，2013），但在外源MeJA诱导下，导致马尾松植株针叶中萜类组分变化的细胞学机制仍不清楚。

萜类化合物（terpenoids）是植物次生代谢物中的一类重要化合物，许多萜类化合物被植物用于防御外来植食性害虫和其伴生致病真菌的侵害，是植物重要防御物质（Erbilgin & Colgan，2012）。萜类化合物经甲羟戊酸途径（MVA）和 5-磷酸脱氧木酮糖/2C-甲基4-磷酸-4D-赤藓糖醇途径（DOXP/MEP）途径合成。这两种途径存在于植物细胞内的不同位置，分隔却非绝对独立，其中共有的少量代谢物可以在质体膜上相互交换（Kasahara et al， 2002）。少量来自细胞质中 MVA 途径的产物可以进入质体，形成部分单萜和二萜（Arigoni et al， 1997）。

萜类物质可以被锇酸固定成为嗜锇滴，根据细胞中嗜锇滴的分布，可以说明萜类物质合成的场所与转运情况（梁社坚和吴鸿，2010；Fahn & Benayoun， 1976）。因此，国内外许多学者采用电子显微镜观测了萜类物质在细胞结构上的变化。然而由于锇酸与萜类物质之间的结合并非特异性反应，其灵敏度不高，且嗜锇滴的分布及变化情况并不能精确显示萜类物质在细胞器间的转移。酶细胞化学方法是研究萜类物质的合成过程和分泌途径的有效方法。电镜酶细胞化学（electron microscopic cytochemistry of enzyme）采用电子显微镜超薄切片技术，研究细胞中各种酶在超微结构水平上的分布及其在细胞生理和病理过程中的变化，以及这些变化与细胞功能的关系（郑国锠和谷祝平， 1987）。本研究通过外源喷施茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），分析了马尾松针叶解剖构造及萜类合成酶活性细胞化学定位的变化，以期揭示马尾松诱导抗性机制中萜类物质生物合成的细胞学基础，为深入开展马尾松诱导抗虫性的分子调控机制提供科学参考。

1材料与方法

1.1 试验处理

选择长势良好、高度为20～30 cm，未受虫害、无机械损伤的盆栽健康马尾松幼苗（来自广西宁明县派陽山林场桐棉松），喷洒茉莉酸甲酯（茉莉酸甲酯购买于Sigma-Aldrich Chem.Co.，纯度>95%）。根据预备试验结果，本研究选择处理后马尾松毛虫拒食性明显、GC-MS分析萜类组分相对含量变化较大，而植株受伤害程度相对较轻的MeJA实验处理浓度，即0.2 mmol·L-1（pH 7. 0，含0. 01%吐温-20），对照（control）为蒸馏水（pH 7. 0，含0. 01%吐温-20）。将处理溶液叶面喷施马尾松幼苗，每次喷施溶液量每盆100 mL，每个处理重复30盆，共处理60盆。连续处理幼苗4周，每2 d喷施一次，共喷施14次，停止喷施5 d后采样测定。采样时，对照、MeJA 处理各选取8株幼苗，每个处理每个重复选取1株，每株选择在处理进行期间形成的健康、完全伸展的成熟针叶束。处理在人工气候箱（PQX-250）中进行，温度25 ℃/20 ℃（昼/夜），光周期12 h，光强6 000 lx，相对湿度85%。

1.2 试验方法

1.2.1 松毛虫拒食性观察马尾松毛虫是马尾松的优势害虫（章康华等，2002）。本试验在HPS-280生化培养箱内进行，试验条件为温度（25±0.5）℃，光照16 h·d-1，相对湿度60%。在1 000 mL 烧杯内，用各处理的新鲜松针饲养虫龄一致的马尾松毛虫幼虫。选取马尾松毛虫第2代期间幼虫20条，每处理10条，每3 d植株上采集以上各处理新鲜无杂物松针作为马尾松毛虫的食物来源，然后根据幼虫摄食量来判断MeJA处理对马尾松毛虫拒食性的影响。幼虫摄食量的计算采用李镇宇等（1998）的方法：每日取食量=（当日投食量-次日残留剩余量）×（1-失水率）。

1.2.2 次生代谢物质GC-MS分析从对照和MeJA中每处理取样10株，将样叶经流水冲洗干净后，切下约10 mm烘干后磨成粉作为样品备用。样品用正己烷浸提制备，正己烷浸提液经旋转蒸发仪减压浓缩至干，然后加入正己烷溶解，过滤，滤液待进样分析。重复制样3次。仪器采用7890A / 5975C型GC-MS联用仪（美国Agilent公司生产），气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane（30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm）弹性石英毛细管柱；柱温为100 ℃，以3 ℃·min-1速率升温至180 ℃，又以10 ℃·min-1速率升温至250 ℃；汽化室温度250 ℃；FID检测器加热器250 ℃；载气为体积分数99. 999%的高纯氦气；载气流量1.0 mL·min-1；进样量4.0 μL，分流进样，分流比40∶1。质谱条件：EI离子源温度230 ℃；MS四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；接口温度280 ℃；溶剂延迟3.4 min；质量范围80～500 amu。数据通过Agilent Chemstation化学工作站NIST05a.L质谱数据库检索，并与标准谱图对照，鉴定各组分峰，并按峰面积归一化法计算求得各化学成分在挥发油中的相对质量分数。

1.2.3 叶片显微构造观察马尾松幼苗经MeJA喷施处理4周，并停止喷施5 d后的24 h内，分别选取对照和MeJA处理中生长健壮、无病虫害部位的功能针叶为试验材料，观察马尾松针叶叶肉组织与细胞显微构造的变化。取样时，每处理取样3株，每株取3根针叶，切成小块后，每处理至少取10个小块进行观察。叶肉组织与细胞制样与观察的方法分别如下：

将叶片经流水冲洗干净后，切下5～8 mm长度的针叶，转入FAA 固定液进行，依次用30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%酒精系列脱水，然后进行透蜡和包埋。最后用转动切片机切片，进行番红固绿对染后用阿拉伯中性树胶封片，观察叶肉组织解剖构造并显微拍照。

将叶片横切成3 mm×4 mm大小叶块，以2% OsO4固定，酒精梯度脱水并包埋于环氧树脂（Epon 812）中，用超薄切片机 Leica-ULTRACUT型（ 德国）切片。超薄切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色后，在电子透射显微镜（JEM-1230型，日本） 下观察细胞构造并照相。

1.2.4 萜类合成酶活性测定采用上海岚派生物科技有限公司48T的检测试剂盒进行萜类合成酶活性测定。具体试验流程如下：

从对照和MeJA中每处理取样3株，每株分别准确称取针叶0.5 g，加入4.5 mL 0.01mol·L-1 的PBS匀浆液（pH=7.4），迅速研磨样品至完全匀浆状。4 ℃离心20 min左右（2 000～3 000 r·min-1），仔细收集上清，进行标准品的稀释与加样，用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液（将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释30倍）洗涤，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。用封板膜封板后置37 ℃温育30 min。每孔加满洗涤液洗涤，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL，终止反应（此时蓝色立转黄色）。加终止液后15 min以内，以空白孔调零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。用标准物的活性与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品活性，再乘以稀释倍数，即为样品的实际活性。

1.2.5 萜类合成酶细胞化学定位参照李爱明（2004）和Kenneth（1987）的方法，制作超薄切片，方法略有改动。从对照和MeJA中每处理取样3株，分别将针叶切成0.1 mm3大小，迅速投入由0.05 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.0配制而成的4%甲醛和1%戊二醛的固定液中12 ℃固定10～30 min。二甲砷酸钠缓冲液洗涤3次，每次20 min，在3 mmol·L-1的铁氰化钾（0.05 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液配制，pH7.0）溶液中室温预孵育20 min，随后用方法洗涤。在如下孵育液中室温孵育45 min。

孵育液的组成如下：含乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A的完全孵育液中，2 mg·mL-1铁氰化鉀，1 mg·mL-1醋酸铀，0.8 mg·mL-1乙酰辅酶A钠盐，1.6 mg·mL-1乙酰乙酰辅酶A钠盐，0.05 mol·mL-1二甲砷酸钠缓冲液，pH7.0；加热使酶失活的对照（固定后，在90 ℃的二甲砷酸钠缓冲液中处理20 min，再预孵育，然后孵育）。孵育完后，在2%锇酸（0.05 mol·L-1二甲砷酸钠缓冲液，pH7.0）中室温固定1 h。二甲砷酸钠缓冲液洗涤。系列酒精（50%、70%、85%、95%、100%）脱水，环氧丙烷过渡，EPON812和环氧丙烷渗透，EPON812包埋。35 ℃聚合24 h，45 ℃聚合24 h，60 ℃聚合24 h。每处理至少取10个样块进行观察，切片后，经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜下观察与拍照 。

1.3 数据处理

数据处理采用SPSS 19.0统计分析软件进行t检验差异显著性分析。其中，不同小写字母表示在α=0.05水平对照与MeJA处理间各指标差异达显著水平。

2结果与分析

2.1 马尾松诱导抗性分析

从图1可以看出，在MeJA喷洒处理下，马尾松毛虫幼虫在处理植株松针上的取食量与对照相比差异达显著水平。MeJA处理7 d时，马尾松毛虫龄期为3龄，马尾松针叶上取食的幼虫日平均取食量为每头0.15 g，为对照植株针叶上取食量的71.4%；处理14 d时，马尾松毛虫龄期为4龄，为对照取食量的59.5%；处理达21～28 d时，马尾松毛虫龄期为5～6龄，仅为对照取食量的26.5%～32.0%。

从幼虫各发育时期取食量的变化来看，在处理21 d以上时，幼虫龄期达5～6龄，在对照植株上取食量显著增加，为3龄期取食量的3.6～5.1倍；而在MeJA处理下，处理14～28 d时，幼虫龄期为4～6龄，随着幼虫龄期增长幼虫取食量变化不明显，均为3龄期取食量的1.6倍左右。

以上结果表明，在MeJA处理植株松针上的取食量都比未处理对照植株松针上小，且MeJA处理时间越长，与对照植株松针上幼虫取食量的差异越明显。这说明，马尾松毛虫对MeJA处理后的马尾松植株松针产生了明显的拒食性，即是说在MeJA处理下，马尾松对松毛虫的诱导抗性增强。

在MeJA处理下，植物产生的诱导抗性与MeJA诱导产生的抗性物质有关（王立春等，2008；冯宏祖等，2013）。为进一步分析MeJA处理植株中抗性物质的变化，对松针中萜烯类、有机酸类、醇类等次生代谢物质进行了GC-MS分析。

经GC-MS检测，根据含量与匹配度较高的检出化合物，马尾松植株松针以萜烯类物质为主，其对应的总离子流气相色谱图如图2所示。其中，对照植株松针中萜烯物质占检出化合物总量的80.1%；而MeJA处理植株松针中萜烯物质含量占检出化合物总量的97.4%。从萜烯组分及相对含量变化来看，以单萜、二萜类物质所占比例较大，经MeJA处理后其相对含量明显增加，其中对照植株松针中单萜、二萜类物质为35.7%，MeJA处理为61.5%。

2.2 针叶显微构造变化

从针叶显微构造观测结果来看，与对照相比，外源喷施MeJA 4周后，马尾松针叶角质层增厚，树脂道分泌物增多，内皮层明显增厚，细胞排列整齐、体积变小（图版Ⅰ：B）；电镜下观察，叶肉细胞内叶绿体数目减少，叶绿体体积增大，叶绿体类囊体、基粒片层结构增多，淀粉粒极为明显，液泡变小，细胞质变浓（图版Ⅰ：D）。

2.3 萜类合成酶活性变化

从图3可以看出，MeJA处理后马尾松幼苗针叶中萜类合成酶活性显著增加。萜类合成酶是萜类化合物合成的关键酶，其活性越高，萜类物质含量越高。根据GC-MS分析检测结果，0.2 mmol·L-1 MeJA处理4周后针叶中萜类化合物组分变化不大，但萜类物质相对含量明显增加（图2），这与本试验测定的萜类合成酶活性结果是相吻合的。

2.4 萜类合成酶细胞化学定位

本研究进一步分析MeJA处理下马尾松针叶中萜类生物合成与代谢场所的变化，对萜类合成酶活性进行了细胞化学定位观察。萜类合成酶细胞化学定位是按照细胞中萜类合成酶反应产物亚铁氰化铀沉淀的多少和部位来判断萜类合成酶的活性和分布。在加热使酶失活的对照中，几乎没有发现反应产物亚铁氰化铀（图版Ⅱ：A，C），而经酶活性反应的切片中则可见亚铁氰化铀沉淀（颗粒性状不规则，较嗜锇颗粒密集）均匀分布（图版Ⅱ：B，D），这说明萜类合成酶反应活性观察结果是可靠的。

电镜分析结果表明，萜类合成酶在马尾松针叶细胞内主要分布在叶绿体膜、质膜及细胞壁等膜系统中（图版Ⅱ：B，D）。马尾松幼苗针叶细胞内叶绿体结构完整，叶绿体内有嗜锇颗粒分布，叶绿体内可见淀粉粒。与对照相比，MeJA处理4周后萜类合成酶活性在叶绿体膜上活性明显增强（图版Ⅱ：D，如箭头所示）。

3讨论与结论

在本研究中，经0.2 mmol·L-1MeJA处理4周，马尾松植株针叶中萜类物质增多，马尾松毛虫拒食性明显，马尾松诱导抗性增强，这与王立春等（2008）的研究结果是相似的。从细胞解剖构造来看，经MeJA处理后马尾松植株松針表皮角质层与内皮层增厚，细胞排列紧密，外生树脂道中分泌物增多，叶绿体体积增大、叶绿体内类囊体片层结构明显增加。马尾松树脂道中形成的产物主要为萜烯物质，并以单萜、二萜类化合物所占比例较大（李爱民，2004）。在本试验GC-MS分析检测中，MeJA处理后检出化合物中萜类物质的相对含量增加，高达97.4%，其中单萜、二萜类化合物占61.5%，较对照植株增加了25.8%。初步认为，MeJA促进了马尾松树脂道中萜类，尤其是单萜、二萜类化合物的形成。高等植物通过光合同化CO2合成并积累形成葡萄糖，而葡萄糖经过一系列转化生成苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，并进一步合成为萜类等次生物质（Bartram et al， 2006； Eisenreich et al， 2010）。叶绿体是植物进行光合作用的重要场所，而萜类物质的生物合成与光合作用过程密切相关（王凌健等，2013）。这说明，外源喷施MeJA诱导马尾松针叶中萜类物质含量的增加，可能与其叶肉细胞中叶绿体构造的改变有关。

萜类合成酶直接影响萜类化合物的生物合成（Tholl， 2006）。以往研究发现，不同抗性品种白松在单萜、倍半萜、二萜等萜类合成酶组成性表达上均没有什么差异。但在创伤后16 d，抗性树与易感树的单萜合成酶和倍半萜合成酶在转录水平上表现出显著性差异，创伤导致抗性树和易感树的萜类合成酶在转录水平上的增加（Byun-McKay et al， 2006）。在本研究中，萜类合成酶活性在MeJA处理4周后，相较对照萜类合成酶活性显著增加。这与MeJA处理下，马尾松幼苗针叶中萜类化合物相对含量明显增加的变化趋势是一致的。

萜类合成酶通过催化前体底物香叶酯二磷酸、法呢基焦磷酸、=牛儿基=牛儿基焦磷酸分别形成单萜、倍半萜和二萜等萜类物质（龚治等，2010；岳跃冲和范燕萍，2011）。因此，萜类合成酶根据其功能可以分为单萜合成酶、倍半萜合成酶和二萜合成酶等类型。从萜类物质的合成代谢过程来看，由于萜类合成酶的变化，不同萜类化合物分别在细胞质、线粒体、质体等不同的细胞场所完成（王凌健等，2013）。本试验萜类合成酶细胞化学定位观察结果发现，相较对照，MeJA处理后诱导了萜类合成酶在细胞膜系统活性定位的增强，尤其是在叶绿体膜上的酶活性定位明显增加。从GC-MS检测结果是来看，MeJA处理下检出化合物中单萜、二萜的相对含量明显增加。单萜、二萜合成酶主要位于质体中（龚治等，2010；岳跃冲和范燕萍，2011；王凌健等，2013），叶绿体是质体中的一种，这即是说，质体上萜类合成酶活性增加将有利马尾松诱导抗性中萜类物质的增加。通过改变质体（叶绿体）的结构发育完整性、稳定性及该场所萜类合成酶活性的生理生化与分子生物学基础，来实现对马尾松诱导抗虫性的调控，这为今后深入开展马尾松的诱导抗性机制提供了新的思路。

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