东方泽泻实时荧光定量PCR内参基因的筛选及AoSS基因的组织表达特性分析

刘青芝 谷巍 孙云飞 吴启南 巢建国 桑晓华 王小浩 刘琪

摘要：【目的】筛选适用于东方泽泻实时荧光定量PCR（qRT-PCR）的内参基因，并分析其鲨烯合酶基因（AoSS）的表达特性，为后续研究东方泽泻原萜烷型三萜生物合成调控及诱导机制打下基础。【方法】从东方泽泻转录组中选取内参基因18S rRNA、EF1α、GAPDH、ACT、UBQ和UBC，应用qRT-PCR检测其在不同组织和激素处理下的表达情况，并借助Delta CT、GeNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder对其表达稳定性进行分析评价。以筛选到的内参基因分析AoSS基因在不同组织中的表达情况。【结果】18S rRNA、GAPDH和EF1α基因在東方泽泻不同组织的表达稳定性较高，但18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性均较高。以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参分析AoSS基因在东方泽泻不同组织中的表达量情况，结果显示，AoSS基因在东方泽泻不同组织中均有表达，其表达情况基本一致，均在东方泽泻块茎中表达量最高，其次是叶柄和叶，而在根中表达量最低。【结论】18S rRNA、GAPDH和EF1α基因是研究东方泽泻不同组织中基因表达分析的首选内参基因；18S rRNA、EF1α和UBC基因是研究激素处理下基因表达的首选内参基因。AoSS基因的表达具有组织特异性，其可能在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能。

关键词： 东方泽泻；内参基因；鲨烯合酶（SS）；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）；表达特性

中图分类号： S567.239 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1467-09

0 引言

【研究意义】东方泽泻[Alisma orientale（Sam.） Juzep]的干燥块茎具有利水渗湿、泄热通淋及降血脂等功效（Zhao et al.，2013；Miyazawa et al.，2016），其主要药效成分为原萜烷型三萜类（Kim et al.，2013；Mai et al.，2015；Zhang et al.，2017）。该类成分主要通过甲羟戊酸（MVA）代谢途径合成，其中，鲨烯合酶（SS）为三萜类化合物生物合成途径中的关键酶，可将碳源流向三萜类化合物，即催化法呢基焦磷酸（Farnesyl diphosphate，FPP）合成鲨烯（申修源等，2013；Gu et al.，2015）。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测东方泽泻SS基因（AoSS）在不同组织器官中的表达情况，对研究AoSS基因在东方泽泻中的功能与作用机制具有重要意义。但qRT-PCR结果准确性常受反转录效率和引物特异性等因素的影响，因此，需选择稳定表达的内参基因进行误差校正及标准化，才可获得更加准确、可靠的数据（Bjarnadottir and Jonsson，2005；Gutierrez et al.，2008；Maroufi et al.，2010）。【前人研究进展】目前，关于植物内参基因筛选的报道较多，常用内参基因有18S核糖体RNA（18S rRNA）、多聚泛素酶基因（UBQ）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）等。这些内参基因在不同物种、植物组织及不同处理下，其表达水平差异较大（Chi et al.，2012；Kozera and Rapacz，2013；Patankar et al.，2016；Xiao et al.，2016）。李竹君等（2013）研究发现，泛素结合酶（UBC）基因可用于穿心莲不同组织中其他基因表达水平的校正；孙亚丽等（2014）研究发现，GAPDH基因是低浓度铜胁迫下天蓝苜蓿根的最佳内参基因；许明等（2017）通过检测6个内参基因在显齿蛇葡萄不同组织器官中的表达情况，结果表明18S rRNA、GAPDH和肌动蛋白（ACT）基因均可作为齿蛇葡萄不同组织中基因表达分析的内参基因。SS位于MVA途径流向萜类和甾醇合成途径的分支，其活性和含量直接影响次生代谢产物的合成（张风侠等，2009），目前已在牛樟芝（Antrodia camphorata）、甜瓜（Cucumis melo）、雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）、三七（Notoginseng Radix）和铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）等植物中克隆获得（吴耀生等，2007；张岗等，2013；刘雨佳等，2016；黄海霞等，2017；原晓龙等，2017）。本研究课题组前期已克隆获得AoSS基因全长，并通过体外酶促反应发现其表达具有组织特异性（申修源等，2013；刘青芝等，2017）。【本研究切入点】目前，鲜见有关筛选内参基因用于东方泽泻AoSS基因在不同组织中表达情况分析的研究报道。【拟解决的关键问题】在课题组前期建立的泽泻转录组数据库中选取18S rRNA、转录延伸因子基因（EF1α）、GAPDH、UBC、UBQ和ACT作为内参基因，采用qRT-PCR技术检测其在不同组织和激素处理下的表达稳定性。利用筛选到的内参基因分析东方泽泻AoSS基因在不同组织器官中的表达特性，为后续东方泽泻基因表达研究提供必要的校正依据，同时也为东方泽泻AoSS基因分子调控机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试材料东方泽泻来源于道地产区福建建瓯种植基地，引种在南京中医药大学仙林药苑。反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司，其他常规化学试剂均为国产或进口分析纯。主要仪器设备：PCR反应扩增仪（Bio-Rad，美国）、Gel Doc XR+凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）、蛋白核酸分析仪（Eppendorf，德国）和实时荧光定量PCR仪（ABI7500，美国）。

1. 2 激素处理与样品采集

选取生长健康且长势一致的东方泽泻幼苗移栽至装有15 kg风干稻田土的花盆中。试验分为2种处理即正常组（正常生长条件）和激素处理组。激素处理组：参考李清等（2015）的方法，在幼苗叶片（包括叶面和叶背）上分别喷施赤霉素（GA，100 μg/mL）、水杨酸（SA，150 μg/mL）、脱落酸（ABA，150 μg/mL）和茉莉酸甲酯（MeJA，0.3 mmol/L），以布满叶面刚滴下为宜，立即套上保鲜袋，喷施24 h后剪取叶片分装于冻存管中，置于液氮中保存。正常组：分别采集东方泽泻同一植株的叶、块茎、根和叶柄样品分装于冻存管中，于液氮中保存备用。

1. 3 总RNA提取和cDNA第一链合成

按照RNA提取试剂盒说明提取叶片样品总RNA，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，并以蛋白核酸分析仪检测RNA纯度和浓度。参照反转录试剂盒说明反转录合成cDNA第一链，于-20 ℃保存备用。

1. 4 引物设计及扩增片段特异性检测

参考张玉芳等（2014）、杨晶等（2017）、张兰等（2017）研究报道，并根据课题组已建立的东方泽泻转录组数据库，选取18S rRNA、EF1α、ACT、GAPDH、UBQ和UBC为候选内参基因，利用Primer Premier 5.0设计内参基因和AoSS基因（GenBank登录号JX866770）的引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 5 PCR扩增

利用设计的引物序列进行PCR扩增以验证引物的特异性。PCR反应体系20.0 μL：10×PCR缓冲液2.0 μL，10 nmol/L正、反引物各1.0 μL，25 mmol/L dNTP 1.0 μL，cDNA模板1.0 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0 μL，5 U Taq DNA聚合酶0.5 μL，ddH2O补足至20.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s；52～60 ℃ 30 s；72 ℃延伸1 min，进行35个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保存，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1. 6 qRT-PCR检测

利用qRT-PCR检测各内参基因的表达情况。反应体系20.0 μL：qPCR SYBR Green SuperMix 10.0 μL，10 nmol/L正、反引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，无菌超纯水补足至20.0 μL。将其置于荧光定量PCR仪上进行扩增，扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 40 s，进行40个循环。每个基因设3个重复，以2.0 μL无菌超纯水为模板作为阴性对照。qRT-PCR试验结束后，仪器自动读取Ct。

1. 7 标准曲线绘制

将反转录合成的cDNA进行梯度稀释，以其为模板进行qRT-PCR检测，以cDNA浓度的对数值为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。根据公式E=10-1/k-1计算扩增效率（E）和线性相关系数R2（k为斜率）。

1. 8 内参基因的表达稳定性评价

先利用Delta CT、GeNorm、Normfinder和BestKeepe对6个内参基因的表达稳定性进行统计学分析，最后使用RefFinder对内参基因的表达稳定性进行综合评价。其中，利用geNorm和Normfinder分析数据时，根据内参基因的相对表达量计算出其表达稳定性值（M），Delta CT和BestKeeper无需转换，直接根据Ct进行稳定性分析。RefFinder则整合上述4种分析方法，对各基因单独使用4种分析方法评价时的排名计算几何平均值，得出综合排名指数，以筛选出稳定性较好的内参基因。

1. 9 AoSS基因表达情况检测

利用上述筛选获得的内参基因，qRT-PCR检测AoSS基因在正常生长条件下不同组织（块茎、叶、根和叶柄）中的相对表达量。反应体系和扩增程序同1.6。AoSS基因相对表达量用2-ΔΔCt法进行计算。

2 结果与分析

2. 1 内参基因和AoSS基因的PCR扩增结果

由图1可知，6个内参基因和AoSS基因扩增条带单一，无杂带和引物二聚體，长度为100～250 bp，与预期结果一致。

2. 2 内参基因和AoSS基因的扩增特异性及扩增效率检测结果

由图2可知，内参基因和AoSS基因的熔解曲线单一，且重复性好，表明qRT-PCR检测结果准确性和专一性高，可用于后续的qRT-PCR检测。6个内参基因的标准曲线相关系数（R2）均大于0.990，且扩增效率为98.483%～103.528%，各引物扩增效率均符合qRT-PCR的要求（表2）。

2. 3 内参基因的表达稳定性分析结果

2. 3. 1 Delta CT分析 计算各内参基因的平均标准偏差（SD），其SD越小，基因表达稳定性越高。由图3-A可知，6个内参基因在东方泽泻不同组织中表达稳定性排序为GAPDH>EF1α>18S rRNA>UBQ>UBC>ACT，说明在不同组织中GAPDH基因的表达最稳定，其次是EF1α基因和18S rRNA，而ACT基因稳定性最差。由图3-B可知，不同激素处理下，6个内参基因在东方泽泻叶片中的表达稳定性排序为UBC>EF1α>18S rRNA>GAPDH>UBQ>ACT，即激素处理下UBC基因的表达稳定性最好，ACT基因的表达稳定性最差。

2. 3. 2 GeNorm分析 使用GeNorm对内参基因表达稳定性进行分析，计算各内参基因的表达稳定性值（Expression stability value，M），对基因的表达稳定性进行排序，M越大，表明基因表达稳定性越差；反之，其表达稳定性越好，其中，M<1.5的内参基因被认为表达相对稳定。由图4-A可知，6个内参基因在东方泽泻不同组织中的表达稳定性排序为GAPDH=EF1α>UBC>18S rRNA>UBQ>ACT，说明GAPDH和EF1α基因的表达稳定性最好。由图4-B可知，不同激素处理下，6个内参基因在东方泽泻叶片中的表达稳定性排序为UBC=EF1α>GAPDH>18S rRNA>UBQ>ACT，表明UBC和EF1α基因的表达稳定性最好，ACT基因的表达稳定性最差。

2. 3. 3 Normfinder分析 Normfinder程序分析内参基因的表达稳定性，M越小，则基因表达越稳定。由图5-A可知，6个内参基因在东方泽泻不同组织中的表达稳定性排序为GAPDH=EF1α>18S rRNA>UBQ>UBC>ACT，即在不同组织中GAPDH和EF1α基因的表达稳定性最好，ACT基因的表达稳定性最差。由图5-B可知，不同激素处理下，6个内参基因在东方泽泻叶片中的表达稳定性排序为UBC=EF1α>GAPDH>18S rRNA>ACT>UBQ，即在不同激素处理下UBC和EF1α基因的表达稳定性最好，UBQ基因的表达稳定性最差。

2. 3. 4 BestKeeper分析 利用BestKeeper分析内参基因表达稳定性，SD越小，基因的表达稳定性越好，当SD>1时，说明基因表达不稳定。如图6-A所示，6个内参基因在东方泽泻不同组织中的表达稳定性排序为GAPDH>18S rRNA>EF1α>UBC>ACT>UBQ，在不同组织中ACT与UBQ基因的SD>1，说明二者表达稳定性最差，不适合作内参基因。如图6-B所示，不同激素处理下，6个内参基因在东方泽泻叶片中的表达稳定性排序为18S rRNA>UBC>EF1α>GAPDH>ACT>UBQ，18S rRNA的SD最低，表明其表达稳定性最好。

2. 3. 5 RefFinder分析 使用RefFinder对内参基因的稳定性进行综合评价及排名。由图7-A可知，东方泽泻不同组织中6个内参基因表达稳定性排序为GAPDH>EF1α>18S rRNA>UBC>UBQ>ACT。由图7-B可知，在不同激素处理下内参基因表达稳定性排序为UBC>EF1α>18S rRNA>GAPDH>ACT>UBQ。

综上所述，18S rRNA、GAPDH和EF1α基因在东方泽泻不同组织中的表达稳定性较高，但18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性较高。UBQ和ACT基因在不同组织和激素处理的表达稳定性均较差，不适合作内参基因。

2. 4 AoSS基因的表达分析

分别以18S rRNA、EF1α和GAPDH为内参基因分析AoSS基因的相对表达量，结果如图8所示。AoSS基因在东方泽泻不同组织中均有表达，其中，在块茎中的表达量最高，其次是叶柄和叶，而在根中表达量最低。可见，以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因作为内参时，AoSS基因在东方泽泻各组织中的表达情况基本一致，说明这3个基因表达稳定性较高，适合作基因定量表达分析的内参基因。

3 讨论

qRT-PCR具有较高的灵敏性、准确性和重复性，已广泛应用于植物分子生物学中基因表达定量研究中，而合适的内参基因是保证定量结果的前提（Wan et al.，2010；张玉芳等，2014；Hashemi et al.，2016）。常用的内参基因多数为管家基因，其编码蛋白参与细胞的基础代谢过程，如GAPDH参与糖酵解过程，ACT参与细胞分裂，18S rRNA参与核糖体循环等（Ohdan et al.，2005；朱海生等，2016）。盡管这些基因在不同细胞中的表达相对稳定，但并不是在所有组织或试验条件下均可稳定表达。许多研究证实，内参基因的选择不存在通用型，使用不合适的内参基因将对数据分析造成偏差（张玉芳等，2014）。因此，利用qRT-PCR检测目的基因的表达情况，应根据不同物种、基因家族和试验条件等选取稳定的内参基因进行校正，才可保证试验结果的可靠性。

本研究从东方泽泻转录组数据中选取6个常见的内参基因，并借助Delta CT、BestKeepe、GeNorm和NormFinder分析其表达稳定性，结果发现，不同软件获得的内参基因表达稳定性排序存在差异，其原因是不同软件输入的原始数据、运算原理等不同，致使内参基因的表达稳定性排序存在一定差异。因此，有必要利用RefFinder进一步评价内参基因的稳定性，避免使用单个软件分析产生的偏差。本研究综合上述5个软件分析结果表明，18S rRNA、GAPDH和EF1α基因在东方泽泻不同组织中表达均较稳定，18S rRNA、UBC和EF1α基因在不同激素处理下的表达稳定性均较高。为进一步验证该结果，本研究利用qRT-PCR技术检测AoSS基因在不同组织中的表达情况，结果显示，以18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参时，AoSS基因在东方泽泻不同组织中的表达情况基本一致，说明这3个内参基因表达稳定性较高，适合作基因表达分析的内参基因，但不同物种可能存在差异。

SS定位于内质网膜上，可催化两分子法尼基焦磷酸生成一分子鲨烯，鲨烯为三萜类化学成分的共同前体（申修源等，2013；刘青芝等，2017）。本研究利用筛选到的18S rRNA、GAPDH和EF1α基因为内参分析东方泽泻不同组织器官中AoSS基因的表达情况，结果发现，其在块茎中的表达量最高，其次是叶柄和叶，而在根中最低。该结果与刘青芝等（2017）的AoSS蛋白组织分布结果基本一致，证明该基因的表达具有组织特异性。推测其原因是，块茎为东方泽泻萜类成分形成的主要器官，也是贮藏器官，故其AoSS基因表达量较高。不同物种SS基因表达特性存在明显差异。如吴耀生等（2007）、张岗等（2013）分别运用qRT-PCR技术检测SS基因在铁皮石斛和三七不同组织中的表达情况，结果发现，SS基因在铁皮石斛根中的表达量高于茎和叶，但在三七根中其表达量高于茎和芦头。本研究通过筛选合适的内参基因以检测AoSS基因的表达情况，为东方泽泻原萜烷型三萜生物合成途径阐明及其调控机制研究打下基础，也为后续东方泽泻诱导机制研究提供合适的内参基因。

4 结论

18S rRNA、GAPDH和EF1α基因是研究东方泽泻不同组织中基因表达分析的首选内参基因；18S rRNA、UBC和EF1α基因是研究激素处理下基因表达的首选内参基因。AoSS基因的表达具有组织特异性，其可能在东方泽泻的生长发育中发挥重要的调控功能。

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（責任编辑 陈 燕）