重庆市白术根腐病发生危害及其病原菌生物学特性

杨成前 吴中宝 余中莲 蒲盛才 雷美艳 杨天健

摘要：【目的】明确重庆市白术根腐病发生危害情况及其病原菌种类、生物学特性，为该病害的预测、防治及白术抗病育种提供理论依据。【方法】2017年3～8月，每隔30 d对重庆市白术产区进行白术根腐病田间症状及危害情况调查；采用组织分离法结合柯赫氏法则获得白术根腐病致病菌，根据病原菌的形态特征对病原菌进行种类鉴定，并考察不同培养基、碳氮源、pH、温度等因素对病原菌菌丝生长和产孢等的影响。【结果】白术根腐病在田间有块茎腐烂型和须根腐烂脱落型2种症状，其中块茎腐烂型占发病植株的69.68%，为主要症状类型。将2种来源的白术根腐病病原菌接种于4种不同白术栽培类型，结果发病症状也以块茎腐烂型为主。引起2种症状的病原菌均为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysprum Schl.）。最适宜白术根腐病病原菌生长的培养基为PSA培养基；菌丝生长最适碳、氮源分别为蔗糖和甘氨酸；最适产孢碳、氮源分别为D-果糖和亮氨酸；菌丝在5～45 ℃均能生长，最适温度为25～30 ℃，产孢及孢子萌发最适温度为30 ℃；菌丝在pH为3～11时均能生长，最适pH为7，产孢及孢子萌发最适pH为6。【结论】重庆市白术根腐病表现为块茎腐烂型和须根腐烂脱落型2种症状，病原菌均为尖孢镰刀菌（F. oxysprum），其症状表现与白术栽培类型的抗病性相关。

关键词： 白术根腐病；发生危害；尖孢镰刀菌；生物学特性

中图分类号： S435.672 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）08-1561-07

0 引言

【研究意义】白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）为菊科多年生草本植物，以根茎入药，系大宗常用中药材，在浙江、安徽、湖北、江西、湖南和四川等地均有栽培（杨舒婷等，2013）。白术栽培中常受根腐病危害，根腐病常年发生率在30%左右，严重时达60%～70%，甚至绝收，是制约白术生产发展的障碍之一（倪方方等，2017）。近年来，重庆市白术种植面积逐年扩大，为贫困山区农民脱贫致富主推中药材之一，但随着种植面积的扩大其根腐病发生也日趋严重，成为影响白术产量的主要因素。因此，了解重庆市白术产区白术根腐病田间发生危害规律，并对其病原菌、生物学特性和致病性等进行研究，对当地白术根腐病预测、防治及抗病品种选育等均具有重要意义。【前人研究进展】引起白术根腐病的病原菌种类较多，且不同地域报道的病原菌种类不同。在四川宝兴县白术根腐病主要致病菌為砖红镰刀菌（Fusarium lateritium）（朱磊等，2012）、恩施州为角担菌（Ceratobasidium sp.） （游景茂等，2016）、贵州为尖镰孢菌（F. oxysprum）（张礼维，2015）及由尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、燕麦镰刀菌和半裸镰刀菌等多种镰刀菌和立枯丝核菌复合侵染引起（臧少先等，2005）。白术根腐病主要有湿腐和干腐2种症状报道（臧少先等，2005；陈小均等，2014）。【本研究切入点】目前，各地关于白术根腐病病原菌种类的研究报道较多，且症状多样，但针对重庆市白术根腐病症状类型及病原菌、生物学特性、致病性研究等的报道较少。【拟解决的关键问题】本课题组在2012～2017年的生产调查中发现，重庆市白术产区白术根腐病症状有须根腐烂脱落型和根茎腐烂型。本研究针对重庆市白术根腐病须根腐烂脱落型和根茎腐烂型2种症状类型进行田间危害情况调查，并分别对其病原菌进行分离、纯化和致病性测定，同时对病原菌的生物学特性进行初步研究，根据病原菌的形态特征和培养性状进行种类鉴定，为该病害的预测、综合防治及白术抗病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试品种：重庆白术产区4种栽培类型白术（由重庆市药物种植研究所提供），分别为阔叶高株、阔叶矮株、狭叶高株和狭叶矮株。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 白术根腐病田间危害情况调查 调查地点位于重庆市白术主要产区酉阳腴地乡。2017年3～8月，每隔30 d对酉阳腴地乡白术种植基地进行根腐病田间症状及危害情况调查。选择5个地块，每个地块采用五点法取样，每点调查100株，统计白术根腐病发病株数，计算发病率。

1. 2. 2 病原菌分离及纯化 分别采集田间须根腐烂脱落型和根茎腐烂型2种症状类型的白术根腐病病株，病样经75%乙醇表面消毒后，从病健交界处挑取小块病组织，经70%酒精表面消毒后置于PDA培养基中28 ℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取菌落边缘菌丝转皿培养，再单孢分离纯化。病原菌的具体分离操作参照《植病研究方法》（方中达，1998）。

1. 2. 3 白术根腐病菌致病性测定 将病原菌在PDA培养基上扩繁，培养9 d后，刮取菌丝和孢子，纱布过滤去除菌丝，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板计数，将浓度调至1.0×107个/mL。每钵灭菌土壤与150 mL孢子悬浮液混合，待移栽白术种苗。选择健康的4种类型白术栽种，种苗用5%次氯酸钠溶液浸泡1 min后移栽到营养钵中。设2个来源症状的病原菌处理，每处理每个白术类型接种10 钵，每钵栽种1株，共80株，浇施灭菌水，接菌后第30 d调查不同类型白术发病程度，计算病情指数；从病株上再次分离病原菌，并与最初的接种菌进行比较，完成柯赫氏法则验证。

白术根腐病病情级别判定标准： 0级，叶片无症状，解剖根茎组织白色；1级，根茎组织有点状变褐，须根有的变褐；2级，根茎组织变褐面积占球茎面积的1/4以下；3级，根茎组织变褐面积占球茎面积的1/2左右，须根变黑褐色，植株出现轻度萎蔫；4级，根茎组织1/2以上至全部面积变褐或腐烂，须根黑褐色或出现烂根；5级，整株枯死。

1. 2. 4 病原菌形态观察 将病原菌接种在PDA培养基上28 ℃恒温培养，观察记录菌落颜色、形态、气生菌丝的疏密程度。使用奥林巴斯CX41RF光学显微镜观察产孢结构、分生孢子种类与形态，测量分生孢子的大小。根据病原菌菌落、孢子形态特征和培养性状，参照《真菌鉴定手册》（魏景超，1979）进行病原菌种类鉴定。

1. 2. 5 病原菌生物学特性研究

1. 2. 5. 1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响

将直径5 mm的病原菌菌块接种于固体培养基中央，在25 ℃恒温下培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径，每处理重复3次。供试培养基：PDA培养基（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL），PSA培养基（马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、水1000 mL），玉米粉培养基（玉米粉300 g、葡萄糖20 g、琼脂17 g、水1000 mL），燕麦培养基（燕麦片300 g、葡萄糖20 g、琼脂17 g、水1000 mL），寄主煎汁培养基（白术根状茎200 g、葡萄糖20 g、水1000 mL），查彼培养基（KNO3 2 g、KH2PO4 1 g、KCl 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、FeSO4 0.01 g、蔗糖30 g、琼脂17 g、水1000 mL）。

1. 2. 5. 2 不同碳、氮源对病原菌菌丝和产孢量的影响 以查彼培养基为基础培养基，以等量的葡萄糖、可溶性淀粉、木糖、麦芽糖、乳糖和D-果糖6种碳源替换蔗糖，以等量的甘氨酸、胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、尿素和（NH4）2SO4 6种氮源替换NaNO3。每处理重复3次。28 ℃恒温箱中培养7 d后，用十字交叉法测量菌落直径和产孢量。

1. 2. 5. 3 不同温度、pH对病原菌菌絲生长和孢子萌发的影响 取直径5 mm的病原菌菌块接种在PSA培养基中央，分别置于5、10、15、20、25、30、35、40和45 ℃共9个温度处理，于恒温培养箱中培养7 d后，测量菌落直径和产孢量，每处理重复3次；将新鲜孢子制成孢子悬浮液，孢子浓度为10×16倍镜下每视野30～50个孢子；悬滴法于5、10、15、20、25、30、35、40和45 ℃共9个温度下进行培养，经24 h后分别检查孢子的萌发率。将直径5 mm的菌块接种在由0.1% HCL和0.1% NaHO调节pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10和11的PSA培养基上，28 ℃恒温箱中培养7 d后，测量菌落直径，测定产孢量；用柠檬酸—磷酸二氢钾缓冲液配制pH为2～12、梯度为1的孢子悬浮液，悬滴法28 ℃培养24 h后，检查其萌发率。每处理重复3次。

1. 3 统计分析

采用SPSS 19.0对试验数据进行统计分析，运用新复极差法进行差异显著性检验。根据下列公式计算病害的病情指数。

2 结果与分析

2. 1 白术根腐病症状观察及危害情况调查结果

白术根腐病在田间具有2种症状，分别为块茎腐烂型（图1-A）和须根腐烂脱落型（图1-B），其中块茎腐烂为主要症状，占发病植株的69.68%（表1）。块茎腐烂型症状：白术根茎呈褐色湿腐，须根和根茎全部腐烂，仅剩残余木质纤维，潮湿时烂根茎表面生有白色霉状物，并伴有难闻气味，干燥时，块茎呈黑色粉状。须根腐烂脱落型症状：白术块茎须根脱落，植株地上部分失水干枯，块茎上着生点呈黑褐色小点，但未腐烂，可保持到收获期，且有部分植株可重新发芽。

2. 2 白术根腐病菌致病性测定结果

在4种白术栽培类型植株上，来源于须根腐烂脱落型和块茎腐烂型症状的病原菌均具有致病性，平均病情指数分别为56.590%和59.580%（表2），以阔叶高株类型病情指数最高，平均达69.995%，狭叶矮株类型病情指数最低，为41.625%；2种来源的病原菌接种在4种类型的白术植株上均可出现块茎腐烂症状（图2-A），其中部分狭叶矮株植株上接种病原菌后可重新长出新叶（图2-B），与田间须根腐烂症状一致。

2. 3 白术根腐病菌显微观察及鉴定结果

白术根腐病病原菌菌落呈圆形，白色，培养基无色或黄色，纤细，中间高，气生菌丝平铺。孢子着生在分生孢子梗顶端，孢子梗侧生或单生，较短；大型孢子呈镰刀形，无色，两头尖，稍弯，分隔，1～4隔，以2～3隔居多，大小20.66～37.08 μm×2.27～4.13 μm；小型孢子呈圆形或椭圆形，无色，0～1隔，大小2.06～10.66 μm×2.48～4.13 μm。根据病原菌形态特征，将白术根腐病病原菌鉴定为尖孢镰刀菌（F. oxysprum Schl.）。

2. 4 白术根腐病病原菌生物学特性

2. 4. 1 不同培养基对病原菌菌丝生长的影响 病原菌在6种供试培养基上均能生长，接种培养7 d后，不同培养基上的菌落直径和菌丝生长稀疏程度存在明显差异（图3和图4），其菌落直径大小依次为：PSA培养基>查彼培养基>寄主煎汁培养基>燕麦培养基>PDA培养基>玉米粉培养基。其中，以PSA培养基上致病菌株的生长最好，菌落生长平整，菌丝绵密厚实，边缘规则，菌落直径最大，达7.23 cm；玉米粉培养基上致病菌株的生长最差，菌落平整，但菌丝生长稀疏、薄、细且透明，菌落直径为4.00 cm。

2. 4. 2 不同碳、氮源对病原菌菌丝生长和产孢的影响 病原菌在7种供试碳源上均能生长，其中，以蔗糖为碳源的菌丝生长速度最快，菌落直径最大，达6.78 cm，其余依次为葡萄糖、D-果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖和木糖；蔗糖、葡萄糖和麦芽糖为碳源的菌丝生长较紧密，乳糖为碳源的菌丝生长最稀疏；产孢量以D-果糖最高，达3.79×104个/mL，乳糖最低，产孢量为0.73×104个/mL（表3）。

病原菌在7种氮源的培养基上均能生长，其中，以甘氨酸为氮源的菌丝生长速度最快，菌落直径达6.40 cm，其余依次为亮氨酸、NaNO3、胱氨酸、赖氨酸和尿素，以（NH4）2SO4最慢，菌落直径为1.34 cm，几乎不生长；亮氨酸、甘氨酸、NaNO3和赖氨酸为氮源的菌丝生长密度较大，产孢量也较高，以亮氨酸的产孢量最高，达3.89×104个/mL，以（NH4）2SO4为氮源的产孢量最低，为0.35×104个/mL。

2. 4. 3 不同培养条件对病原菌菌丝生长和产孢的影响 温度和pH对病原菌菌丝生长、产孢均有显著影响（表4）。病原菌在5～45 ℃的PSA培养基上均能生长，最适培养温度为25～30 ℃，产孢最适温度为30 ℃；病原菌生长的最高和最低温度分别为45和5 ℃，高于或低于此温度条件病原菌产孢较少或不产孢。病原菌在pH 3～11的PSA培养基上均能生长，在pH 5～9时菌丝生长速度较快，其中以pH 7的最快，此条件下菌落直径为6.96 cm，而产孢最适pH为6，此条件下产孢量为4.31×104个/mL。

2. 4. 4 不同温度和pH对孢子萌发的影响 病原菌孢子在10～40 ℃均能萌发，在20～35 ℃下孢子萌发较好，最适萌发温度为30 ℃，此时的萌发率为49.03%；在5和45 ℃下的孢子萌发率为0（表4）。病原菌孢子在pH 3～11时均能萌发，在pH为6时孢子萌发率最高，为33.00%；当pH达12时，其孢子萌发率为0（表4）。表明弱酸环境条件下有利于白术根腐病菌孢子萌发。

3 讨论

目前对白术根腐病症状的报道主要有干腐和湿腐2种，但2种症状均危害白术的根茎，导致白术根茎整体腐烂。本研究在2012～2017年间通过大田白术根腐病调查发现，白术根腐病症状有须根腐烂脱落型和根茎腐烂型2种，分别占发病植株的31.32%和69.68%，其中须根腐烂脱落型症状至今未见相关报道。对来源于白术须根腐烂脱落型和根茎腐烂型2种症状的病原菌进行致病性测定、形态鉴定和生物学特性研究，确定2种症状来源的病原菌均为尖孢镰刀菌。

白术根腐病病原菌种类呈多样性，且不同产区病原菌种类也不相同（臧少先等，2005；朱磊等，2012；张礼维，2015；游景茂等，2016）。由于本研究仅对重庆白术产区进行白术根腐病调查，因此需进一步收集不同产区白术根腐病危害情况，并对病原菌进行分离及生物学特性研究，明确不同产区白术根腐病发生情况和主要致病菌种类，为各地白术根腐病预测及综合防控提供理论依据。

本研究将来源于白术须根腐烂脱落型和根茎腐烂型2种症状的病原菌接种在4种白术栽培类型上，其致病症状均表现为块茎腐烂症状，其中又以狭叶矮株平均病情指数最低，为41.625%。同时，部分狭叶矮株接种病原菌可重新长出新叶，与田间须根腐烂型症状一致。这可能与尖镰孢菌具有致病力分化现象和白术不同栽培类型的抗病性不同相关。镰孢菌（Fusarium）具有致病力分化的生理小种现象，如香蕉枯萎病尖镰孢菌（F. oxysporum）（曹永军等，2011；聂燕芳等，2017）、串珠镰孢菌（F. moniliforme）（潘月敏等，2011）、瓜類枯萎病菌（F. oxysporum）（张硕，2013）和大豆镰孢根腐病菌（F. solani）（张丽等，2014）等均存在致病力分化及小种专化型。因此，针对尖镰孢菌致病力分化现象，下一步需采集白术根腐病菌菌株和白术品种进行致病力分化和白术抗病性测定，为白术抗病育种提供理论基础。

4 结论

通过对来源于重庆市白术主产区白术根腐病2种症状的病原菌进行形态特征及生物学特性研究，确定2种症状来源的病原菌均为尖镰孢菌（F.oxysporum），其症状表现与4种白术栽培类型抗病性相关。白术生产中，应根据白术根腐病危害特点和植株抗病性，选择具有优良抗性植株进行留种或抗病育种；根据病原菌生物学特性，选择微碱或中性土壤的地块进行种植，并适时采取药剂防治。

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（责任编辑 麻小燕）