大鼠关节软骨发育不同阶段12种硒蛋白的表达

王一清，郭东贤，赵益童，郭源旭，孙梦瑶， 黄 璜，袁 莹，韩 燕，孙 健,3,

(1. 西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系，陕西西安 710061； 2. 西安交通大学口腔医院，陕西西安 710004；3. 环境与疾病相关基因教育部重点实验室，陕西西安 710061)

硒是哺乳动物必需的微量元素之一，在机体中以硒蛋白的形式发挥作用。硒蛋白是含有硒代半胱氨酸(Sec)的蛋白质，也是体内硒代谢的主要形式。Sec是由密码子UGA介导的翻译插入，DNA中对应序列为TGA。Sec参与硒蛋白活性中心的构成。人体内已发现的25种硒蛋白包括谷胱甘肽过氧化物酶家族(GPXs)、硫氧还蛋白还原酶家族(TRXRs)、脱碘酶家族(DIO)及硒蛋白H、I、K、M、N、O、P、S、T、V、W、X，SEP15[1]。

硒与骨软骨发育密切相关[2-4]。但硒蛋白与骨软骨相关的研究集中在与骨疾病发生相关联的多态性分析、抗氧化功能，以及血硒浓度、硒蛋白浓度及活性的测定等方面。包括Dio2、SelS基因多态性与骨关节炎(osteoarthritis, OA)的发生密切相关[5-6]；IL-1β使培养牛软骨细胞H2O2在线粒体堆积，导致线粒体损伤，间接使GPx活性升高[7]；类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者滑膜细胞作为氧化应激的发生器极高表达TrxR1[8]；胫软骨发育障碍(tibial dyschondroplasia, TD)的鸡生长板Dio2低表达[9]。硒蛋白在软骨细胞的表达能够调节骨的重吸收和骨重建，影响细胞内外的氧化信号、转录因子活性、蛋白质翻译后修饰，清除活性氧中间产物(ROIs)。然而，硒蛋白在骨软骨中的生物学意义和对疾病治疗的潜在功能还知之甚少[10]，甚至没有硒蛋白在关节软骨表达谱的报道。本文取软骨生成不同阶段大鼠股骨软骨，研究硒蛋白在关节软骨表达的时间特异。

1 材料与方法

1.1实验动物分别取0 d(d0)、7 d(d7)、14 d(d14)、21 d(d21)、28 d(d28)、35 d(d35)、42 d(d42)龄近交系DA大鼠各10只(雌雄各5只，瑞典隆德大学引进)，动物在SPF级动物房繁育，环境维持室温(25±3)℃，相对湿度40%～60%，每日人工照明12 h。动物垫料经高压蒸汽灭菌，动物饮灭菌凉开水，喂无菌颗粒饲料。

1.2主要试剂DEPC购于深圳晶美公司，Trizol试剂购于Invirtogen公司，反转录试剂盒(RevertAidTM)购于加拿大Fermentas Life Sciences, International公司，12种硒蛋白(GPx1、GPx2、GPx3、GPx4、TrxR1、TrxR2、TrxR3、Sel S、Dio1、Dio2、Sel P、Sel W)引物和内参GAPDH引物由奥科生物公司合成。GPx1(IHC)抗体购于EPITOMICS公司。

1.3方法

1.3.1动物处理 大鼠麻醉处死后，打开股骨关节，小心剥离出右后肢股骨头软骨，立即放入液氮后储存于-80 ℃；小心截取左后肢股骨，浸入40 g/L多聚甲醛中固定。

1.3.2组织学HE染色检测软骨增殖、分化情况 左后肢股骨浸入100 mL/L甲醛溶液中固定，脱钙，常规石蜡包埋、切片，切片厚度6 μm，HE染色后观测骨软骨发育不同阶段关节软骨增殖与分化基本情况。

1.3.3RT-PCR和RT-qPCR检测12种硒蛋白在大鼠股骨表达情况 剥离出右后肢股骨头软骨Trizol©法提取总RNA，试剂盒法反转录得cDNA，储存于-20 ℃备用。由NCBI网站获取大鼠12种硒蛋白及GAPDH(内参)mRNA序列全长，利用Primer5软件设计跨外显子引物。引物及PCR条件见表1。将20 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。取d0、d21、d42大鼠关节软骨cDNA，对Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio2、SelS 5种硒蛋白表达进行RT-qPCR定量。

1.3.4免疫组化检测大鼠股骨Gpx1表达情况 取d42大鼠左后肢股骨组织切片，常规脱蜡至水，Gpx1抗体4 ℃孵育16 h，加二抗，DAB显色。

1.4统计学分析所有计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，所有统计分析用Statview软件完成。相关分析采用Pearson检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1大鼠骨软骨发育不同阶段股骨头HE染色光镜下HE染色显示，各时间点所取大鼠股骨头，d0可见全部为关节软骨细胞(图1A)；d7可见软骨细胞增殖，第1次骨化中心出现(图1B)；d14可见软骨细胞增殖，第1次骨化中心形成并且开始成骨，2次骨化中心出现(图1C)；d21可见软骨细胞增殖，1次骨化中心继续成骨，2次骨化中心形成(图1D)；d28(图1E)软骨细胞继续增殖；d35可见软骨细胞继续分化，1次骨化中心成骨，2次骨化中心形成骺板使长骨生长(图1F)；d42可见软骨细胞进一步分化，骨形成，骺板继续使长骨生长(图1G)。

2.212种硒蛋白在股骨头关节软骨细胞中的表达变化PCR产物电泳发现，Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2、SelS 6种硒蛋白在骨软骨发育不同阶段呈现不同程度的差异表达(图2A)。RT-qPCR定量结果可知，在d0、d21、d42大鼠关节软骨细胞中Gpx1表达在d21(P=0.004 3)和d42(P=0.005 1)显著升高，Dio2表达在d21(P=0.013 5)和d42(P=0.014 8)也显著升高；同时Gpx2和Gpx4稳定表达(图2B)。

2.3GPX1在股骨头关节软骨细胞中的表达情况d42大鼠股骨的免疫组化检测结果(图3)显示，GPX1特异性的在骺板部位呈高表达，而在股骨的其他部位表达非常低。

表1大鼠12种硒蛋白基因Real-timePCR引物序列及反应条件

Tab.1 Primer sequences and reaction conditions of 12 selenoproteins in rats for Real-time PCR

基因名称序列(5'-3')退火温度循环数产物大小(bp)Gpx1上游:5'-GGCTCACCCGCTCTTTACCTTC-3'下游:5'-CGCACTGGAACACCGTCTGG-3'60℃30168Gpx2上游:5'-GCCGTGCTGATTGAGAATGTGG-3'下游:5'-TCCTGATGTCCGAACTGGTTGC-3'60℃30137Gpx3上游:5'-ACTCCTGCCCTCCCACTGC-3'下游:5'-GCTGCCTGCCGCCTCATATAG-3'60℃30199Gpx4上游:5'-AATTCGCAGCCAAGGACATCG-3'下游:5'-CCAGGATTCGTAAACCACACTCG-3'60℃30168TrxR1上游:5'-AAAGTTTACTCAGCAGAGCGGTTC-3'下游:5'-GCACATTCCAAGGCGACATAGG-3'60℃30170TrxR2上游:5'-TTCAGCCAAGCACATAGTCATCG-3'下游:5'-GCCAATACCAGTGAGGAAGCC-3'60℃30187TrxR3上游:5'-CTCTGTCCTTCTTCGTGGCTTTG-3'下游:5'-TGTATGTCCCTTCTACTGTCTCTGG-3'60℃30191Dio1上游:5'-TGACCAGTTCAAGAGACTCGTAGAC-3'下游:5'-TTCGGTGCTGCCTGATGTCC-3'60℃30128Dio2上游:5'-TCTCCTCGGTGGCTGACTTCC-3'下游:5'-GCACATCGGTCCTCTTGGTTCC-3'60℃30130SelP上游:5'-CGCTTACTGTGAGAAGAGGTGTG-3'下游:5'-ATGGTGCTTGTGGTGGTTATGC-3'60℃30136SelS上游:5'-TTCCTGCACGTCACAGTGGG-3'下游:5'-TTAAAGCCCTCAGTCGCAGG-3'60℃30115SelW上游:5'-CGGGTTCTTTGAAGTGACGGTAG-3'下游:5'-GGCGGCTTTGATGGCAGTC-3'60℃30115Gapdh上游:5'-CGGCAAGTTCAACGGCACAG-3'下游:5'-GAAGACGCCAGTAGACTCCACGAC-3'65℃28148

图1SD大鼠左后肢股骨头骨软骨发育7个时间点关节软骨的HE染色

Fig.1 Left femoral head morphology of different developmental stages (×200)

A～G：产后0、7、14、21、28、35、42 d。

图2SD大鼠发育过程中不同时间点软骨硒蛋白表达情况

Fig.2 Expressions of selenoproteins in the femoral head cartilage of SD rats

A：股骨头软骨细胞12种硒蛋白表达PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。6种硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2、SelS呈现不同程度的差异表达；B：d0、d21、d42大鼠股骨头软骨细胞4种硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx4、Dio2表达结果(RT-qPCR)Gpx2和Gpx4稳定表达，Gpx1和Dio2表达随着大鼠软骨发育显著升高。*P<0. 05，**P<0.01。

图3d42DA大鼠股骨GPX1表达情况(免疫组化)

Fig.3 GPX1 expression of the femoral head cartilage with immunohistochemistry assay at D42 in DA rats

3 讨 论

大骨节病(Kashin-Beck disease, KBD)是一种由于骨软骨发育异常所导致的慢性、地方性、变形性骨关节病，以四肢关节软骨和骺板软骨的近骨性、多发性、灶性带状坏死为主，病因尚未明了，低硒环境因子和生物致病因子联合作用是大骨节病主要病因假说之一[3,11]。硒对大骨节病发病过程的保护作用还有待进一步研究[3,11]。Sec-tRNA基因敲除小鼠表现出类似KBD的骨骼发育异常[12]，而硒蛋白作为机体内硒的最主要代谢形式，说明硒缺乏导致的硒蛋白合成障碍在KBD发病的作用是不容忽视的。

真核生物硒蛋白合成的调控，是通过位于mRNA 3′-UTR区的一个特殊的茎环结构——硒代半胱氨酸插入元件(selenocysteine insertion sequence, SECIS)作为顺式作用元件，同时有Sec-tRNA、特异翻译因子SelB、丝氨酰-tRNA合成酶、硒代半胱氨酸合成酶(SelA)、硒代磷酸合成酶(SelD)等多种反式作用因子的协同作用进行的[12-16]。另外，TrxR基因在SBP2作用下能够进行选择性剪接，导致特定条件下产生有活性(长片段)与无活性(短片段)两种不同的表达产物[17]，缺硒时，合成的TRXR1 C端缺少-Gly-Cys-COOH 2个氨基酸残基，导致细胞迅速的死亡[18]。

SAVASKAN等[19]发现，在小鼠大脑内，Gpx4呈时空特异性表达：胚胎神经元细胞高表达、出生后低表达、成年小鼠神经胶质细胞不表达，同时Gpx4敲除小鼠因大脑不能发育导致死胎。UFER等[20]证实GPx4的这种作用，受到其合成过程中富鸟嘌呤序列结合因子1(guanine-rich sequence-binding factor 1,Grsf1)的调控，Grsf1作用于Gpx4转录后加工，上调Gpx4表达，促进小鼠大脑发育；当siRNA敲除Grsf1后，小鼠出现大脑发育迟缓等类似Gpx4低表达的症状，而Gpx4过表达则症状缓解。

本研究发现，在骨软骨发育过程中，硒蛋白Gpx1、Gpx2、Gpx3、Gpx4、Dio2呈现不同程度的差异表达，尤其是Gpx1在青春期及性成熟大鼠长骨的骺板特异的高表达。本课题组将进一步研究找出调控硒蛋白在骺板特异表达的分子机制及信号通路，进而了解硒蛋白在骨骼发育中的真实作用及这种作用对骨软骨发育调控的机制。在骨骼发育过程中，当由于低硒或其他因素导致某种硒蛋白合成障碍时，是否会有类似TrxR1截短体导致细胞迅速死亡[17]，或者Gpx4合成障碍导致大脑发育异常的情况，引起骺板深层软骨细胞坏死，进而引起大骨节病的发生?如果这种关键硒蛋白的表达调控软骨内化骨的作用机制成立，那么低硒诱发骨发育疾病的流行病学特征就容易理解了，即硒不是影响骨软骨发育的直接因素[3]，但硒缺乏可能会导致硒蛋白生物合成的障碍[15]。这提示骨软骨发育可能与关键硒蛋白的生物合成有关，而这种合成受到了多种因素和多种层次的调控。因而，以硒蛋白表达的时空特异性入手，获得骨软骨发育不同阶段硒蛋白表达谱，进而找到关键硒蛋白，了解关键硒蛋白表达调控的机制就成为了重要环节，这也正是本研究的目的所在。我们期望本研究对骨软骨发育的调控机制研究、骨软骨发育异常导致的大骨节病病因研究及关节软骨细胞异常凋亡导致的骨关节炎的病因研究开辟新的途径，进一步找到相关的诊断标记分子和未来药物的靶分子。