紫草油对肛瘘术后组织修复中Smad3表达的影响

赵诚 王未娟 张琼

作者单位：福建中医药大学附属人民医院肛肠科，福建 福州 350004

紫草油在我院多年应用于肛肠病术后的治疗，在创面愈合方面效果明显，但作用机制不明。Smad蛋白家族是细胞内重要的信号转导蛋白，参与包括细胞增殖、凋亡、迁移、分化等功能。本研究以Smad3因子作为研究对象，从分子生物水平初步阐明Smad3因子表达变化与创面愈合过程中的关系。

1 资料与方法

1.1 诊断标准

按照《肛瘘临床诊治指南（2006版）》[1]制定的标准选取低位单纯性肛瘘作为研究对象。

1.2 病例资料

本研究课题入选的150例肛瘘患者均为福建中医药大学附属人民医院肛肠二科2017年3月—2018年3月住院患者。利用简单随机方法将患者分成紫草油组、凡士林组、肤痔清组三组，每组各50例。

1.3 治疗方法及实验方法

1.3.1 肛瘘切开术 所有病例均在局麻下行“肛瘘切开术”，各组手术当天静滴止血药，手术当天及术后第1 d、第2 d静滴抗生素抗感染。各组患者每日便后温水坐浴，分别予紫草油、凡士林组、肤痔清外用，均匀涂在创面上，厚约1 mm。分别于术后第7、14天留取血清，并记录各组创面愈合时间。

1.3.2 血清提取 各实验组于手术后第7、14天后抽取外周静脉血3～5 ml，离心后利用微量移液器吸取分离上层血清至1.5 ml EP管，置-70℃冻存待测。

1.3.3 RT-PCR法 用RNA提取试剂提取样本中总RNA。总RNA浓度和纯度用使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定，之后RT-PCR进行按两步法。目的基因引物∶ Smad3基因的上游引物序列为5’-GAAATCAGTTCTGGGCTATA-3’，下游引物序列为5’-CTCCAGTATTTGTCCTCTAC-3’（扩增产物长度：100 bP）。内参β-actin序列为：上游5’-ACTCTGTGTGGATTGGTGGC-3’，下游为5’-GAAAGGGTGTAAAACGCAGC-3’（扩增产物长度：155 bP）。PCR反应条件为：扩增程序为：95°30 s，（95℃ 5 s，60℃ 34 s）×40个循环。各样品的目的基因和内参基因分别进行Real-Time-PCR反应。PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

1.3.4 Western-blot法 用细胞裂解液提取总蛋白，考马斯亮蓝法测定各细胞样本蛋白含量，取等量总蛋白用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后进行转膜。将封闭后的膜直接放入一抗工作液中，4℃反应过夜。紧接着放入二抗工作液中作用60分钟。最后曝光及洗片，用image J软件分析灰度值。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0统计软件进行分析处理，计量资料采用（）表示，两样本之间采用t检验，分析多样本比较采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 紫草油治疗肛瘘术后Smad3 mRNA表达情况

研究结果如表1显示，经治疗，术后第14 d紫草油组中的Smad3 mRNA表达低于凡士林组、肤痔清膏组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；说明紫草油能提高降低Smad3 mRNA表达水平，进而促进创面生长，缩短愈合时间。

2.2 紫草油治疗肛瘘术后Smad3蛋白表达情况

Western blotting分析结果显示，凡士林组、肤痔清组、紫草油组治疗肛瘘术后Smad3蛋白表达逐渐下降。术后第14 d紫草油组Smad3蛋白的表达水平低于其他两组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。提示中药紫草油能有效下调血清Smad3含量，进而促进创面愈合。详见图1、表2。

3 讨论

肛瘘是指肛管或直肠因病理原因与肛周相通的一种异常管道，亦称为肛管直肠瘘[2]。《五十二病方》记载了“巢塞直者，杀狗，取其脬，以穿螽，入直中，炊之，引出，徐以刀去其巢”，这里的“巢者”就是指现代的“肛门瘘管”，肛瘘牵拉切开术由此发展而来[3]。现代医学提倡精准治疗，肛瘘的治疗出现了损伤更小的隧道式手术方式。但由于病变部位的特殊性，一般创面较大且结构较复杂。加之术后患者排便、换药的痛苦大，恢复时间长[4]。此外传统改良术式有治愈率高的优点，但一直存在术后疼痛明显、愈合时间长的问题。近年来各类生物材质逐步应用于肛瘘的治疗术式中[5]，极大地保护了肛门括约肌的功能。现代生物学技术克服了传统改良术式的缺点，但治愈率不高，且价格昂贵，所以针对肛瘘的治疗，在治愈率、术后疼痛、经济负担三者之间找到平衡点也是肛肠科需探讨努力解决的问题。

表1 三组患者术后第7、14 d Smad3 mRNA表达情况 （）

注：三组第14 d比较，*P＜0.05

组别 例数 时间 Smad3（ng/L）紫草油组 50 第7 d 0.603±0.015第 14 d 0.438±0.043*肤痔清组 50 第7 d 0.821±0.019第 14 d 0.704±0.014*凡士林组 50 第7 d 1.008±0.015第 14 d 1.036±0.036

表2 三组患者术后第7、14 d Smad3蛋白相对表达情况 （）

表2 三组患者术后第7、14 d Smad3蛋白相对表达情况 （）

注：3组第14天比较，*P＜0.05

组别 例数 时间 Smad3（ng/L）紫草油组 50 第7 d 0.312±0.021第 14 d 0.253±0.047肤痔清组 50 第7 d 0.522±0.046第 14 d 0.508±0.044*凡士林组 50 第7 d 0.754±0.021第 14 d 0.771±0.036

中医药在肛瘘术后创面修复方面有着丰富的临床实践经验和良好的疗效[6]。紫草油组方中紫草为君药，黄连为佐药。紫草为紫草科植物紫的根。味苦、甘，性寒。入心、肝经。主要功效：活血、凉血、透疹解毒。多用于皮肤溃后，或用于各类慢性溃疡，可收清热消肿、减少渗出，从而可生肌长肉，促进溃疡愈合，特别是创面赤肿及渗出较多者。黄连性寒，味苦，有清热、燥湿、泻火解毒的功效。二味共为君药共奏清热利湿、消肿止痛之功。运用清热利湿化瘀法于肛瘘术后，体现中医外治的优势在临床的应用。

伤口创面的修复过程包括四个步骤：即伤口周围炎症反应、血管再生及肉芽组织的生长、结缔组织和上皮细胞的修复、组织重构以致伤口愈合[7]。Smad作为细胞内重要的信号转导蛋白，可以直接参与TGF-β超家族成员以及骨形态发生蛋白等多个成员的信号传导。Smad蛋白根据功能不同分为受体激活性Smads、共同介导性Smads及抑制性Smads。真正反映TGF-β1/Smad3信号传导通路的激活水平的是活化的smad3表达水平[8-9]。Smad3蛋白能与Smad4形成复合物，促进创面修复相关靶基因的表达[10]。研究表明激活 TGF-β1/Smad3信号通路，增加胶原蛋白的合成，可加速创面的修复[11]。因此Smad3及其产物可以调节创面愈合。过表达Smad3的成纤维细胞合成胶原能力增加，而敲除Smad3后，创伤愈合加速[12]。本实验研究中表明：3组药物干预后Smad3表达逐渐下降。术后第14天紫草油组中的Smad3 mRNA及蛋白表达低于凡士林组、肤痔清膏组，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明紫草油能够干预Smad3因子的表达水平，有效促进创面的愈合。

本实验研究说明紫草油能促进肛瘘术后创面的愈合及缩短愈合时间，可能通过调节Smad3 因子表达水平。因此如何有针对性的、科学的调控Smad3因子表达，也是进一步研究难点。