不同发酵处理对赤霞珠葡萄酒中氨基甲酸乙酯产量的影响

王根杰，李德美，张亚东，辛闻，王宗义

(北京农学院 食品科学与工程学院，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京，102206)

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，简称EC)，是大多数发酵食品(如面包、牛奶等)和酒精饮料(啤酒、白酒、葡萄酒等)生产及贮存过程中产生的一种天然副产物[1]。经研究发现，EC在生物体内代谢时，被细胞色素P-450酶(cytochrome P-450，简称CYP)催化生成N-羟基-氨基-甲酸乙酯，后者诱导Cu2+调控的DNA损伤，引起DNA的氧化和脱嘌呤反应，使基因缺失或突变，这是EC致癌的主要原因[2-4]。2007年，国际癌症研究机构将EC的致癌级别由之前的2B类提升认定为2A类。一些主要葡萄酒生产国也相继制定了本国的葡萄酒中EC含量的限定标准。美国葡萄餐酒中的EC限量为15 μg/L，加拿大、韩国和捷克生产葡萄酒中的EC限量为30 μg/L。目前，我国仍未制定葡萄酒中EC的限量标准。近年来，随着我国居民消费水平的提高，葡萄酒的消费量也日益上升，EC作为一种潜在的致癌物质已经逐渐引起了社会关注并成为了热门研究对象，因此EC限量标准的制定势在必行。

葡萄酒在酿造过程中，尿素与发酵产生的乙醇结合是产生EC的主要途径。尿素的来源主要是酵母代谢氨基酸(主要是精氨酸)和葡萄园施氮肥。氮是酿酒酵母保持发酵能力和生物活性的重要营养元素，氮源的过高或过低都会影响葡萄酒的发酵状态[5]。当发酵葡萄汁中酵母可利用氮(yeast assimiable nitrogen, YAN)含量低于140 mg/L时，会导致酒精发酵迟缓或者停滞[6]；当葡萄汁中的YAN含量在200～480 mg/L时，葡萄酒的酒精发酵处于比较理想的状态[7]。在生产过程中，添加酵母助剂可保证发酵的顺利进行，然而酵母助剂的用量对葡萄酒酿造过程中EC产量的影响研究很少。

本研究的目的是比较不同发酵处理对EC产量的影响，从而找到控制酒精发酵过程中EC含量的酿造工艺，服务于葡萄酒生产。同时，为我国葡萄酒中EC限量标准的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赤霞珠葡萄(Cabernet Sauvignon)，2016年10月采收于河北怀来，成熟状况、卫生条件良好。酒精发酵酵母ST、BO213、F15和酵母助剂THIAZOTE均购自法国LAFFORT公司；铵离子氮试剂盒Megazyme Ammonia Nitrogen Assay Procedure(96 Assays per kit)、氨基酸氮试剂盒Megazyme Primary Amino Nitrogen Assay Procedure(100 Assays per kit)，爱尔兰Megazyme International Ireland有限公司；甲醇、冰醋酸(色谱级)，美国Mreda公司；乙腈(色谱级)，韩国SK chemicals公司；氨基甲酸乙酯标准品、氨基甲酸乙酯内标物(EC-d5)，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

双波长紫外分光光度计，北京Lab-Tech公司；Agilent 6410串联液质仪，美国Agilent公司；Heal Force®Super Series NW超纯水系统，上海Canrex分析仪器有限公司。

1.3 试验设计

本试验研究不同商业酵母在赤霞珠葡萄酒发酵过程中EC产量的差异性，选用ST、BO213、F15三种对氮源具有不同敏感度的酵母进行试验，酵母接种量均为0.2 g/L。根据常规工艺设计，在葡萄酒发酵过程中添加0.2 g/L酵母助剂THIAZOTE。

同时本试验进行不同用量酵母助剂的研究，在接种了0.2 g/L酵母F15(酒庄发酵赤霞珠葡萄酒相同的酵母)的发酵罐中分别添加了0、0.3、0.6 g/L的THIAZOTE酵母助剂，分别记为YNCK、YN0.3和YN0.6。

上述6个处理均设置3次重复，共18个独立发酵单元，分别在发酵初期(比重1.090)、发酵中期(比重1.040)和发酵末期(比重1.000)取样测定。

赤霞珠葡萄汁分析结果显示含糖量233 g/L、酸度(酒石酸计)7.90 g/L、pH 3.22、葡萄汁初始比重为1.096。

葡萄原料→分选→除梗破碎(添加30 mg/L SO2)→酒精发酵→分离→稳定与澄清处理→装瓶

发酵前期温度控制在20～22 ℃，每12 h进行1次压帽操作；发酵中期温度控制在25～28 ℃，每12 h进行2次压帽操作；发酵后期温度控制在22～25 ℃，不进行压帽操作。

1.4 指标测定与方法

采收当天，根据标准[8]在相应葡萄地块进行土样的采集、处理和贮存，测定土壤中的铵态氮和硝态氮含量。葡萄采样结束后，尽快送到实验室进行压榨与澄清处理，同时取葡萄汁样品，贮存于-20 ℃低温冰箱待测。

1.4.1 土壤中铵态氮和硝态氮含量的测定[9]

土壤中铵态氮含量的测定：采用氯化钾浸提-靛蓝比色法，计算公式如下：

(1)

式中：C,显色液铵态氮的质量浓度，μg/kg；V,显色液体积，mL；ts,分取倍数；m,土样的质量，g。

土壤中硝态氮含量的测定：采用紫外分光光度法，计算公式如下：

(2)

式中：C,通过回归方程算出的NO3-N含量；25,测定液的总体积，mL；D,稀释倍数；m,鲜土样质量，g。

1.4.2 葡萄汁中酵母可利用氮的测定[10]

采用试剂盒检测氨基酸态氮和铵离子氮含量。计算公式如下：

(3)

ΔA=(A1-A2)样-(A1-A2)空白

(4)

式(3)中：X1,氨基酸态氮含量，mg/L；V,终体积，mL；MW,氮摩尔质量，g/mol；ε,氮素在波长340 nm处的消光系数；d,光路距离，cm；v,样品体积，mL。

(5)

ΔA=(A1-A2)样-(A1-A2)空白

(6)

式(5)中：X2,铵离子氮含量，mg/L；V,终体积，mL；MW,氮摩尔质量，g/mol；ε,氮素在波长340 nm处的消光系数；d,光路距离，cm；v,样品体积，mL。

可同化氮含量/(mg·L-1)=X1+X2

(7)

1.4.3 葡萄酒理化指标的测定[11]

根据国标GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》测定。

1.4.4 葡萄发酵液或葡萄酒中EC含量的测定[12]

本试验利用EC-d5作内标进行测定，可以有效校正整个分析过程产生的误差，使样品处理更为简易，降低了对人员熟练程度的要求[13]。

样品前处理：将酒样摇匀，立即准确取出1.00 mL于5 mL试管中，准确加入25 μL 10 μg/mL的EC-d5内标工作液，旋涡振荡5 s，吸取样液过0.22 μm滤膜，待分析。

1.4.4.1 液相色谱-质谱条件

XSELECT HSS T3色谱柱(2.1 mm×150 mm，3.5 μm)，Zorbax Eclipse Plus-C18预柱(12.5 mm×2.1 mm，5 μm)。柱温为40 ℃，进样体积为10 μL，流速为0.3 mL/min；流动相A为0.1%(V/V)乙酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱顺序如表1所示。

电喷雾电离源正离子模式(ESI+)，多反应离子监测方式监测，MRM参数见表2。

干燥氮气温度为120 ℃，流速为10 L/min；雾化器压力20 psi；喷雾毛细管电压4 000 V。

表1 梯度洗脱程序表Table 1 The sequence of gradient elution

表2 MRM参数表Table 2 The parameter of multiple reaction monitoring

注：*为定量离子。

1.4.4.2 校正标准曲线和回归方程

按照内标法测定EC含量得到的校正标准曲线如图1所示，线性回归方程为y=7.919 7x+0.006，相关系数R2=0.999 3，方程线性较好，适合本试验中EC的含量测定。

图1 内标法测定EC的校正标准曲线Fig.1 The EC calibration standard curve

1.5 数据统计分析

采用SPSS 22.0进行数据处理与分析，对葡萄酒中的理化指标进行多重比较分析。利用Excel绘制酒精发酵过程中的EC产量变化图。

2 结果与分析

2.1 赤霞珠葡萄园土壤中氮含量及葡萄中YAN测定

氮是酿酒葡萄树体和果实生长的主要营养素。土壤中的氮素可分为有机氮和无机氮，本试验采集葡萄园土样做含氮量测定，其中铵态氮含量为38.68 mg/kg, 硝态氮含量为20.46 mg/kg。土壤中铵态氮含量要高于硝态氮含量，根据河北省葡萄果园地力评价标准，该试验地土壤中的氮处于较低水平[8]。

铵态氮是酵母可同化氮素的主要成分[10]，是酿酒酵母优先利用的无机氮源。土壤中的铵态氮水平会直接影响葡萄果实中的酵母可利用氮含量，经测定葡萄原料中的酵母可利用氮含量为188.53 mg/L。符合葡萄酒发酵所需最低140～150 mg N/L的要求[6]。

2.2 实验葡萄酒理化指标检测

酒精发酵结束后，葡萄酒经自然澄清后，与酒泥分离，经过稳定处理后装瓶，2个月后取样检测葡萄酒的理化指标，结果如表3。

由表3可以看出，不同酵母和不同用量酵母助剂酿造的葡萄酒中理化指标含量均无明显差异。葡萄酒主要理化指标正常，满足酒精度≥7.0%，还原糖≤4 g/L和挥发酸≤1.2 g/L的要求[9]。葡萄酒发酵过程控制合理，符合干红葡萄酒的发酵要求，保证了葡萄酒中EC含量的正常测定。

表3 赤霞珠葡萄酒理化指标Table 3 Physicochemical indexes of Cabernet Sauvignon wine with different treatment

注：同列不同小写字母表示p<0.05水平差异显著。

2.3 不同酵母酿造的赤霞珠葡萄酒中EC产量的差异分析

精氨酸是葡萄汁中含量最丰富的氨基酸之一。在酒精发酵过程中，当发酵液中精氨酸含量过高时，会在酵母菌内代谢产生过量的尿素。酵母细胞内的尿素不会立即降解，使胞内的尿素含量积累过多，酵母菌的氮代谢受到抑制。酵母菌将过多的尿素由胞内释放到发酵液中，尿素和发酵产生的乙醇结合生成EC。

发酵过程中不同酵母酿造的赤霞珠葡萄酒EC产量的差异性结果如图2，结果显示酵母ST、BO213和F15酿造的葡萄酒中EC产量存在差异。随着发酵的进行，酵母菌容易利用的谷氨酸、谷氨酰胺等小分子氮源越来越少，酵母菌开始代谢精氨酸、核苷酸等含氮化合物，其代谢产生的瓜氨酸、氨甲酰磷酸、尿素等分泌到酒体中，与已积累的乙醇反应生成EC[14]。在发酵初、中期阶段，3种酵母酿造葡萄酒均有少量的EC产生，而在不同酵母酿造的葡萄酒之间EC的产量具有差异。发酵末期，酵母BO213与ST、F15相比，酿造的葡萄酒中EC产量分别增长了45.0%和16.0%。这可能与不同酵母需氮量、氮代谢及尿素分泌能力有关。

a-发酵初期(1.090)；b-发酵中期(1.040)，此时添加酵母助剂；c-发酵末期(1.000)图2 不同酵母处理不同发酵阶段的EC产量Fig.2 Comparison of three different yeasts fermented on EC production during fermentation

2.4 不同用量酵母助剂处理酿造的赤霞珠葡萄酒中EC产量的差异

在酒精发酵过程中，酵母进行生长繁殖和代谢，会逐渐消耗葡萄汁中的氮源物质。当发酵液中氮源物质缺乏时，会延缓发酵甚至停滞。酵母助剂的成分主要是(NH4)2HPO4，可以补充酵母所需氮源，加快发酵速率。而过量的(NH4)2HPO4会使酵母代谢过剩，从而产生EC。

本试验酒精发酵过程中，不同用量酵母助剂处理酿造的赤霞珠葡萄酒中EC产量差异性如图3。在发酵中期添加酵母助剂后，不同用量酵母助剂处理酿造的葡萄酒中EC产量与发酵前期相比均有增长，且YN0.3、YN0.6均比对照组YNCK酿造的葡萄酒中EC产量高。与发酵中期相比，YNCK、YN0.3、YN0.6在发酵末期的EC产量分别增长了37.5%、38.0%、33.3%，表明酵母助剂的使用有提高EC产量的风险。而在发酵末期，不同用量酵母助剂酿造的葡萄酒中EC产量差异显著，与YNCK相比，YN0.3和YN0.6酿造的葡萄酒中EC产量分别增加了25.5%和45.5%，结果显示，酵母助剂用量增加所酿造的葡萄酒中EC产量越大。

a-发酵初期(1.090)；b-发酵中期(1.040)，此时添加酵母助剂；c-发酵末期(1.000)图3 酵母助剂不同用量处理不同发酵阶段EC产量Fig.3 Comparison of three different yeast nutrients used on EC production during fermentation

2.5 不同处理获得的赤霞珠葡萄酒中EC含量结果分析

葡萄酒发酵结束后，经过澄清、过滤、装瓶，置于瓶储室(温度在15～20 ℃，空气相对湿度在65%～70%)储存。装瓶2个月后取样，测定各处理获得的赤霞珠葡萄酒中的EC含量如表4。

表4 赤霞珠葡萄酒中的EC含量 单位：μg/LTable 4 EC content in Cabernet Sauvignon wine

由表4可以看出，不同处理酿造的赤霞珠葡萄酒中EC含量均较低，都远低于美国或欧盟限定标准[15]。

3 结论与讨论

本试验主要研究不同发酵处理对赤霞珠葡萄酒中EC产量的影响，选择不同酵母和不同用量酵母助剂发酵进行研究。试验结果表明，在葡萄酒发酵过程中，不同酵母酿造的赤霞珠葡萄酒中EC产量差异显著，就选择的3种酵母而言，酵母BO213的EC产量多于酵母F15和ST。在选择酵母F15的前提下，发酵过程中使用酵母助剂用量多的赤霞珠葡萄酒中EC产量较高，产量高低顺序为YN0.6>YN0.3>YNCK。发酵过程中，赤霞珠葡萄酒中EC产量的变化趋势为，发酵初期阶段和发酵中期阶段产生较少，发酵后期阶段EC产量较多。

在整个实验过程中，测定的赤霞珠葡萄酒中的EC含量范围为1.9～8.0 μg/L，均未超过美国或欧盟限量水平[15]。在实验葡萄园现有的土壤氮素营养水平下，使用酵母ST(接种量为0.2 g/L)或使用酵母F15(接种量为0.2 g/L)且不添加酵母助剂，可以使赤霞珠葡萄酒发酵顺利进行，酿造的葡萄酒中EC的产量符合美国或欧盟的限量标准，同时可以使葡萄酒中的EC产量保持在较低水平。