鸟嘌呤和异亮氨酸促进丁酸梭菌生长

刘颖，杨华，宋昭，陈雄，黄亚男，王志*

1(湖北工业大学，发酵工程教育部重点实验室，湖北省工业发酵协同创新中心，湖北省工业微生物重点实验室，武汉，430068) 2(河南省南街村(集团)有限公司，河南 临颍，462600)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是低G-C含量的革兰氏阳性严格厌氧菌，芽孢偏心或次端生、中部膨大呈梭状、周生鞭毛、具有运动性[1]，广泛存在于肠道、土壤、白酒酿造窖泥和奶酪中。丁酸梭菌因具有调节肠道平衡、增强免疫的功能[2]而受到关注，如：戚薇采用单因素和正交优化，培养32 h的活菌数达到 4.1×108CFU/mL[3]；袁华伟等在最适条件下清液培养源于酒窖泥的丁酸梭菌48 h，细胞数达到1.64×108CFU/mL[4]；赵建新等在优化条件下培养ClostridiumbutyricumZ-10，发酵12 h生物量达到3.6×108CFU/mL[5]，夏会丽等在10 L罐水平(基料体积5 L)批培养丁酸梭菌HBUT-01，细胞数达到9.39 ×108CFU/mL[6]。

丁酸梭菌液体发酵葡萄糖产生大量丁酸、乙酸等分子使培养基pH迅速降低，并伴随着支链淀粉粒[7]积累，而且淀粉粒随着芽孢生成程序启动[8]又被消耗。这使营养体细胞生长周期变短、限制了生物量的进一步增加。枯草杆菌的芽孢程序启动需要Spo0A蛋白的磷酸化[9]，涉及到全局调控子CodY(帮助细胞适应营养贫乏状态的转录调控蛋白)。当效应分子(GTP和/或支链氨基酸BCAAs)与其结合后，会引起CodY构型转变，CodY-GTP或CodY-BCAA才能结合于靶基因的启动子区域，起到调控蛋白的作用[10]，并通过阻遏KinB蛋白的表达来抑制芽孢的形成[11]。虽然梭状芽孢杆菌基因组中无spo0F和spo0B基因，不存在磷酸传递系统[12]，但有文献报道：激活状态的CodY可能通过调控芽孢形成相关基因sinR和opp来抑制Clostridiumdifficile芽孢的形成[13]，使细胞处于营养生长状态。

微生物对营养分子的利用存在一般性规律，如：枯草芽孢杆菌从对数生长到营养物质匮乏的发酵后期，其胞内GTP和BCAAs水平大幅度下降，分别从2 mmol/L和15 mmol/L下降至0.3 mmol/L和2 mmol/L，过程中CodY的调控活性逐步下降，从而使阻遏的靶基因脱阻遏而表达[14]。尽管丁酸梭菌Spo0A的磷酸化过程还没有阐明、CodY对芽孢调控的细节特征也没有明确的报道，但是，由于在Clostridiumbutyricum[15]、Clostridiumacetobutylicum[16-17]和Clostridiumbotulinum[18]中确实存在CodY，因此，有必要在丁酸梭菌发酵葡萄糖生长过程中，通过补加营养分子(如：嘌呤类分子、支链氨基酸)来观察其对细胞生长和芽孢启动的影响。

为了延缓丁酸梭菌芽孢的形成，进一步提高丁酸梭菌的生物量及生长效率，本文在厌氧瓶水平确定了鸟嘌呤和支链氨基酸对丁酸梭菌生长的影响，并在20 L发酵罐水平研究了其对丁酸梭菌生长、酸代谢和芽孢生成的影响，确定了鸟嘌呤和Ile的促生长功能和对丁酸合成调控的基本特征，进一步提高了丁酸梭菌的生物量，为丁酸梭菌的工业化生产提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

丁酸梭菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，为本实验室菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC M 2016628)。

DELTA 320 pH计，梅特勒托利多仪器(上海)有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海精宏实验设备有限公司；TG18M台式高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；Nikon ECLIPSE E100生物显微镜，上海光学仪器五厂；Aglient 7890B气相色谱仪， HNY-211B全温振荡培养箱，天津欧诺仪器仪表有限公司；紫外可见分光光度计，岛津。

1.2 培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖 10；胰蛋白胨10；牛肉浸膏 10；酵母浸粉3；琼脂20。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖16.1，蛋白胨25，酵母浸粉 7；CaCO34.3；MgSO4·7H2O；0.8；K2HPO40.5; MnSO4·H2O 0.02。

所有培养基均分装至100 mL厌氧瓶中，装液量30 mL，加0.6 g/L半胱氨酸，0.5 g/L刃天青(无氧条件(Eh值在-40 mV)下呈无色状态;有氧条件下为红色)，pH 7.2，通氮气除氧5 min，115 ℃灭菌20 min。

1.3 培养方法

种子悬液制备：将-20 ℃保存的丁酸梭菌甘油管接种至厌氧管斜面，37 ℃活化12 h。加3 mL无菌水至种子斜面，制备种子菌悬液。

一级种子液制备：将种子菌悬液以体积分数为2.5%的接种量接至厌氧瓶(种子培养基，装液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培养12 h。

厌氧瓶发酵方法：将一级种子液以体积分数为2.5%的接种量接至厌氧瓶(发酵培养基,装液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培养12 h，周期取样。

1.4 实验设计

1.4.1 单因素优化

配置15 g/L鸟嘌呤溶液，0.22 μm的滤膜过滤除菌。用1 mL无菌注射器向发酵培养基中加入不同体积的鸟嘌呤溶液，使鸟嘌呤终质量浓度梯度为0～0.4 g/L。发酵10 h取样并滚管计数。

分别配置15 g/L的Ile、Leu和Val溶液，0.22 μm的滤膜过滤除菌。分别向发酵培养基中加入1 mL所配溶液(终浓度是0.5 g/L)，发酵10 h取样并滚管计数。

配置15 g/L的Ile溶液，0.22 μm的滤膜过滤除菌。用1 mL无菌注射器向发酵培养基中加入不同体积的Ile溶液，使其终浓度梯度为0～1.0 g/L。发酵10 h取样并滚管计数。

1.4.2 20 L发酵罐分批发酵

一级种子液接种体积分数为2.5%，发酵基料体积14 L。灭菌结束后通入氮气至接种(1 h左右)，转速200 r/min，37 ℃培养12 h左右。

1.5 检测方法

1.5.1 细胞数测定

使用Hungate滚管计数法进行计数[19]。

1.5.2 葡萄糖测定

采用3,5二硝基水杨酸法测定[20]。

1.5.3 有机酸测定

挥发性有机酸丁酸和乙酸采用气相色谱测定。采用气相色谱法测定：安捷伦7890B GC，FID检测器，HP-INNOWax毛细管柱柱长30 m，内径0.53 mm，膜厚1 μm；程序升温条件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。流速 5 mL/min，进样口温度250 ℃，检测器280 ℃[21]。

1.5.4 细胞染色

采用孔雀绿芽孢染色法，质量分数为7.6%的孔雀绿加热条件下染5 min，冲洗干燥后番红染液复染2 min，芽孢染成绿色，细胞其他部分染成粉红色。

2 结果与分析

2.1 厌氧瓶水平发酵基料添加鸟嘌呤对丁酸梭菌生长的影响

GMP在胞内可以通过两种途径生成:从头合成和补救合成。补救合成为磷酸核糖焦磷酸直接与嘌呤碱生成嘌呤核苷酸。因此，添加嘌呤可促进胞内GTP以及嘌呤核苷酸的代谢。

由图1可知，添加鸟嘌呤可显著提高丁酸梭菌的生物量。10 h对照生物量达到3.77×108CFU/mL。添加0.1～0.4 g/L鸟嘌呤组细胞数较对照提高了22.02%～50.92%。其中添加0.2 g/L组的生物量(5.59×108CFU/mL)仅低于0.3g/L和0.4 g/L组1.71%和1.06%。因此选择0.2 g/L为最适添加质量浓度。此外，鸟嘌呤还显著影响了菌体的形态，如图2所示：对照90%左右的菌体已经开始形成芽孢，而添加鸟嘌呤明显减少了芽孢形成的比例，0.2～0.4 g/L的添加量都可以使菌体依然为营养细胞状态，延缓了芽孢形成。

图1 鸟嘌呤对丁酸梭菌生长的影响Fig.1 The effect of guanine on the growth of Clostridium butyricum

图2 鸟嘌呤对丁酸梭菌(10 h)细胞形态的影响Fig.2 The effect of gunanine on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.2 厌氧瓶水平发酵基料添加0.2 g/L鸟嘌呤对丁酸梭菌生长的影响

厌氧瓶水平添加鸟嘌呤对丁酸梭菌代谢的影响如图3所示。添加组的生物量水平整体较高，6 h迅速生长至5.05×108CFU/mL，并与8 h开始二次生长，10 h达到峰值(5.71×108CFU/mL)，比对照8 h的峰值生物量(4.34×108CFU/mL)提高了31.57%。添加组胞外丁酸和乙酸浓度除了在10 h高于对照组外，均分别低于对照3.15%～7.23%和0.92%～24.32%，而且丁酸和乙酸的单位菌体的得率系数(Yp/x)分别为0.37 mg/108CFU和0.42 mg/108CFU，低于对照120.03%和16.67%。说明在厌氧瓶水平，鸟嘌呤可以提高丁酸梭菌生物量，减少丁酸、乙酸的合成。

图3 添加0.2g/L鸟嘌呤对丁酸梭菌代谢的影响(空心标识为对照组，实心标识为添加组)Fig.3 The effect of 0.2 g/L gunanine on metabolism of Clostridium butyricum

2.3 支链氨基酸对丁酸梭菌生长的影响

芽孢程序启动过程Spo0A蛋白的磷酸化[9]涉及到了全局调控子CodY。GTP和/或BCAAs与之结合形成CodY-GTP或CodY-BCAA后，使得CodY构型转变而激活，才能结合于靶基因的启动子区域[10]，通过阻遏KinB蛋白的表达来抑制芽孢的形成[11]。Clostridiumdifficile中激活状态的CodY可能通过调控芽孢形成相关基因sinR和opp的表达来抑制芽孢的形成[13]，使细胞处于营养生长状态。

由于丁酸梭菌中关于BCAAs结合于CodY结构域、进而调控芽孢形成基因表达的特征没有明确的报道，因此，需要确认支链氨基酸的作用。BCAAs对丁酸梭菌生长代谢的影响如图4所示。

图4 支链氨基酸对丁酸梭菌生长(10 h)的影响Fig.4 The effect of BCAAs on the growth of Clostridium butyricum

发酵培养10 h，添加0.5 g/L的Leu和Ile组的生物量分别达到3.6×108CFU/mL和4.32×108CFU/mL，较对照3.5×108CFU/mL分别提高2.8%和20%。同时，支链氨基酸对菌体的形态和芽孢生成产生了显著的影响，如图5所示，Val组和对照组一样在10 h已大量形成芽孢，结合其生物量仅为对照的75%的数据，说明：Val对细胞的影响与枯草芽孢杆菌完全不同，或者0.5 g/L的Val已经对细胞产生了毒性。另外，Leu组芽孢生成也较为明显，只有Ile组菌体形态基本上都维持在梭状形态，而且无芽孢生成，因此选择Ile进行下一步研究。

图5 支链氨基酸对丁酸梭菌细胞形态(10 h)的影响Fig.5 The effect of BCAAs on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.4 不同质量浓度Ile对丁酸梭菌生长的影响

如图6 所示，0.25～0.75 g/L的Ile添加量促进了细胞的生长，发酵10 h的细胞数在(3.92～4.25)×108CFU/mL，较对照(3.53×108CFU/mL)增加了10.73%～20.05%，并以0.5 g/L组为峰值。

图6 不同质量浓度异亮氨酸对丁酸梭菌生长(10 h)的影响Fig.6 The effect of different concentrations of Ile on the growth of Clostridium butyricum

2.5 20 L发酵罐水平鸟嘌呤和Ile对丁酸梭菌生长代谢的影响

20 L发酵罐水平基料添加鸟嘌呤对丁酸梭菌生长代谢的影响如图7所示: 对照组(图7-A)和添加组(图7-B)的葡萄糖从2 h开始被快速利用，8 h分别剩余3.03 g/L和0.71 g/L。添加组糖耗速率较对照提高了26.23%。对照组胞外丁酸从2 h开始积累，6 h达到2.14 g/L，并持续积累至9 h的3.33 g/L。乙酸0～6 h积累至0.69 g/L。添加组的丁酸和乙酸在6 h的质量浓度分别为1.28 g/L和0.47 g/L，9 h的乙酸质量浓度积累至0.7 g/L，丁酸质量浓度在10 h达到3.2 g/L。

A-对照；B-添加组图7 20 L发酵罐基料添加0.2 g/L的鸟嘌呤对丁酸梭菌生长代谢Fig.7 The effect of 0.2 g/L guanine on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

对照组细胞数对数生长至6 h达到峰值(4.32×108CFU/mL)，后自溶至9 h(3.19×108CFU/mL，减少26.16%)。9 h后开始二次生长至10 h达到4.21×108CFU/mL。添加组从2 h对数生长至6 h，达到峰值生物量5.31×108CFU/mL，较对照6 h提高了22.91%。6 h后细胞自溶至9 h，减少了66%，9 h后二次生长至10 h的4.23×108CFU/mL。

基料添加0.5 g/L的Ile对丁酸梭菌生长代谢的影响如图8所示，丁酸梭菌从2 h开始对数生长至7 h达到峰值生物量4.65×108CFU/mL，较对照(图7-A)对数生长期延长1 h，峰值生物量提高7.64%。7 h后细胞自溶，10 h生物量仅有2.56×108CFU/mL，比其峰值生物量减少了44.94%。添加Ile使糖耗减慢，7 h葡萄糖质量浓度为6.71 g/L。胞外丁酸和乙酸从4 h开始积累，均在9 h基本达到峰值，分别为2.42 g/L和0.62 g/L，其中，乙酸含量与对照(图7-A)接近，丁酸较对照组降低了25.38%。

图8 20 L发酵罐基料添加0.5 g/L的Ile对丁酸梭菌生长代谢的影响Fig.8 The effect of 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6 h细胞数达到峰值时，得率系数如表1所示，就细胞对糖的得率而言，鸟嘌呤和Ile效果接近，均提高了17%以上。而且糖酸转化得率(Yp/s)降低了30%以上，与之相对应的，单位菌体的丁酸得率(Yp/x)也下降了40%以上。说明鸟嘌呤和Ile还调控了丁酸合成途径的碳通量，酸得率下降可以降低酸胁迫效应，降低质子外泵的额外能量消耗[22]，从而促进了细胞的生长效率。

表1 峰值生物量(6 h)得率系数Table 1 The yield coefficient at peak biomass

注：其中Yx/s表示单位葡萄糖细胞得率；Yp/s为单位葡萄糖丁酸得率；Yp/x为单位菌体丁酸得率，干重(Y)与*108CFU/mL (X)的关系为Y=1.13X+0.87，R2=0.993 1。

枯草芽孢杆菌中，GTP和Ile作为效应分子协同或单独与CodY结合，激活CodY的调控蛋白作用，而且Ile和GTP的作用效果可以累积[14]。为了确定鸟嘌呤和Ile是否对丁酸梭菌生长代谢具有协同积累调控作用，研究了基料同时添加0.2 g/L鸟嘌呤和0.5 g/L的Ile对其生长的影响，如图9所示。

丁酸梭菌从2 h开始对数生长至6 h达到峰值生物量5.4×108CFU/mL，较对照(图7-A)提高了25%、较单独添加Ile提高16.13%。说明两者对丁酸梭菌的生长确实存在类似于枯草芽孢杆菌的协同促进作用。但是，CodY与效应分子结合的结构域与GTP的结合效率可能更高，因此，当鸟嘌呤与Ile同时添加时，生物量较单独添加鸟嘌呤组无显著性差异。

图9 20 L发酵罐基料添加0.2 g/L鸟嘌呤与0.5 g/L的Ile对丁酸梭菌生长代谢的影响Fig.9 The effect of 0.2 g/L guanine and 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6～9 h细胞自溶(9 h，2.98×108CFU/mL)，后出现二次生长现象，至10 h增加到3.25×108CFU/mL，但较6 h仍然减少了39.81%。细胞峰值时乙酸和丁酸的浓度分别为0.44 g/L和1.29 g/L，较对照(图7-A)降低了36.23%和39.72%。

对比已有文献[3-6]，本研究中使用的菌种在优化条件下发酵培养具有周期短、效率高、细胞生长迅速的明显优势，而有关培养周期、最大细胞生物量的差异则与不同的菌株、培养基组成、发酵工艺参数的控制、启动以及发酵过程厌氧条件的维持差异有关。

发酵批培养(图7～图9)过程存在细胞对数生长至峰值后大幅自溶的现象，这估计也与培养条件(如：厌氧启动基料体积为14 L)和细胞氧化胁迫[23]有关。接种前氮气置换空气1 h难以将溶氧完全去除，培养基中的痕量溶氧可能对丁酸梭菌细胞生长(特别是启动阶段的细胞)产生了氧化胁迫效应，如：丁酸梭菌的碳代谢关键酶-丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶对溶氧很敏感，与氧接触1 h，其酶活性降低50%[24]。本文对照批培养在10 L罐水平(基料体积5 L)条件下的发酵效率[6]就高于本文对照(图7-A)，这估计也与前者基料体积小、厌氧发酵启动条件较好有关。

另外，若在培养过程中(如：对数生长期)外源补加鸟嘌呤和Ile，也涉及到了补料液的厌氧状态以及补料过程对发酵体系厌氧状态的扰动问题。特别是在丁酸梭菌工业发酵的放大过程中，厌氧条件的维持问题会格外突出，因此，下一步将针对氧化胁迫效应、以延长细胞对数生长周期为目标展开系统的研究，包括：补料因子(碳源、氮源、调控因子如鸟嘌呤和Ile)最适补加时间、发酵过程氧化还原电位的优化等，为工业化大规模生产提供理论依据和技术参考。

3 结论

厌氧瓶水平基料添加鸟嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)能分别提高丁酸梭菌的生物量31.57%和20%，而基料添加Val(0.5 g/L)则促进了芽孢生成、抑制细胞生长。20 L发酵罐水平基料添加鸟嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)使丁酸梭菌峰值生物量分别达到5.31×108CFU/mL和4.65×108CFU/mL，较对照分别提高了22.91%和7.64%，同时丁酸的菌体得率系数(Yp/x)较对照分别降低了48.64%和40.54%；当基料同时添加鸟嘌呤和Ile时，丁酸梭菌峰值生物量达到了5.4×108CFU/mL，较对照、单独添加Ile分别提高了25%和16.13%，确定了鸟嘌呤和Ile的促生长功能，为丁酸梭菌的工业化生产提供了参考。