异氟醚抑制低氧/复氧诱导的肾小管上皮HK- 2细胞系内质网应激凋亡

唐 静，胡 玲，刘 奉，李小山，赵梓亦，李国利

(重庆三峡医药高等专科学校 1.病原生物学与免疫学教研室； 2.基础医学部 病理学教研室；3.临床医学系， 重庆 404120； 4.成都中医药大学附属医院，四川 成都 641000)

肾缺血的灌注损伤发生机制复杂，与氧自由基增多、钙离子浓度失衡和能量代谢障碍等密切相关，也是导致急性肾衰竭的主要原因之一[1]。外科手术中肾缺血再灌注损伤是影响预后的主要原因之一。缺血再灌注可导致强烈的内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)并产生细胞凋亡[2]，因此降低缺血再灌注损伤过程中的ERS非常重要。异氟醚是一种外科手术常用的修饰麻醉剂，对手术中产生的缺血再灌注损伤具有调节作用[3- 4,7]。本文研究了异氟醚对肾小管上皮细胞HK- 2低氧/复氧模型中ERS及其诱导的细胞凋亡的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人肾小管上皮细胞系HK- 2(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)。

1.1.2 试剂 Trizol、实时荧光定量PCR预混液和SuperScript III RT-PCR试剂盒(Life Technology公司)；DMEM完全培养基、0.25%胰蛋白酶、青链霉素和10%澳洲胎牛血清(Gibco公司)；DNA序列和引物(上海生工生物技术公司合成)；Annexin V/PI染色试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；Anti-GRP78、Anti-CHOP和anti-caspase- 12 (Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理：将细胞培养于10 cm培养皿中，DMEM完全培养基含有10%胎牛血清和100 U/mL青链霉素。细胞培养在5% CO2、饱和湿度、37 ℃的细胞培养箱内，每72 h更换培养基1次。当细胞汇合度达到80%～90%时传代。

将汇合度50%的细胞置于经95% N2-4.5% CO2-0.5% O2混合气培养箱中放置4 h；加入2.56%异氟醚处理的细胞为异氟醚组；加入相同体积PBS处理的细胞为Mock组；常规条件培养的细胞为对照组。

1.2.2 LDH含量的测定：将不同时间点的培养上清液50 μL加入新的96孔细胞培养板中，再加入50 μL底物，室温避光孵育30 min后，加入50 μL反应终止液，混匀后室温放置10 min，在490 nm下读取吸光度值；然后检测细胞总的LDH值。向原细胞培养孔中加入20 μL溶解酶，37 ℃孵育1 h后，每孔加入50 μL底物，室温避光孵育30 min后，加入50 μL反应终止液，混匀后室温放置10 min，在490 nm下读取吸光度值。计算方法为：上清液LDH分光光度计读取数值除去总的LDH分光光度计读取数值。

1.2.3 MTT法检测细胞增殖：向培养于96孔细胞板中的细胞加入10 μL/孔MTT(125 mg/L)，放置于细胞培养箱中37 ℃反应2 h；去上清液，PBS冲洗3次并加入50 μL/孔二甲亚砜(DMSO)，室温避光孵育30 min，在570 nm下读取吸光度值。

1.2.4 实时定量PCR检测GRP78和CHOP mRNA：用Trizol提取目的细胞的总RNA，根据SuperScript Ⅲ RT-PCR试剂盒说明书操作，进行反转录和荧光定量PCR。PCR程序如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火和延伸1 min，循环40次。涉及的引物序列如下：GRP78，F：5′-CATCACGCCGTCCTATGTC G-3′和R: 5′-CGTCAAAGACCGTGTTCTCG-3′；CHOP，F: 5′-TCTTGACCCTGCTTCTCTGG-3′ 和R： 5′-GCTGT GCCACTTTCCTTTCA-3′；caspase- 12，F：5′-CATCCAA CGGTGTTCTGGTC-3′和R: 5′-TTGCCTGCAATTTGA GCTGT-3′；β-actin，F：5′-CATGTACGTTGCTATCC AGGC-3′和R：5′-CTCCTTAATGTCA CGCACGAT-3′。

1.2.5 Western blot检测GRP78、CHOP和caspase- 12蛋白：目的细胞按1×106个细胞加入500 μL RIPA细胞裂解液的比例混合，并于液氮和37 ℃温水浴反复冻融裂解3次。4 ℃，12 000×g离心10 min沉淀细胞碎片，收集上清液。常规方法制备8%～10% SDS-PAGE胶，120 V稳定电压电泳1.5 h分离蛋白；半干转膜法(按恒流0.5 mA/cm2)进行转印。将目的抗体按1∶1 000的比例稀释，并室温孵育2 h，用辣根过氧化物酶标记的相应种属的二抗孵育，ECL显色，X线暗室曝光并显影定影。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡：收集处理好的细胞，按照Annexin V-FITC/PI染色试剂盒说明书操作，并用流式细胞仪分析凋亡率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 异氟醚处理对低氧/复氧模型HK- 2细胞损伤和细胞增殖的影响

低氧/复氧模型HK- 2细胞LDH释放量较对照组增加，细胞增殖减少(P<0.05)。与mock组细胞相比，2.56 %异氟处理4和8 h的LDH降低，MTT升高(P<0.05)(图1)。

2.2 异氟醚处理对低氧/复氧模型16HBE细胞凋亡的影响

低氧/复氧模型16HBE细胞中的凋亡率显著高于未处理组细胞(P<0.05)。2.56%异氟醚处理4和8 h时使细胞凋亡率降低(P<0.05)(图2，3)。

*P<0.05 compared with control group; △P<0.05 compared with Mock group图1 异氟醚诱导的HK- 2细胞低氧/复氧模型LDH释放量(A)和细胞增殖的变化(B)

图2 异氟醚诱导的HK- 2细胞低氧/复氧模型凋亡的annexin V-FITC/PI荧光染色的影响Fig 2 Effect of isoflurane on hypoxia/reoxygenation induced apoptosis by annexin V-FITC/PI

*P<0.05 compared with mock group图3 异氟醚诱导的HK- 2细胞对低氧/复氧诱导的凋亡率(%)的影响Fig 3 Effect of isoflurane on apoptosis induced by

2.3 异氟醚处理对低氧/复氧模型16HBE细胞内质网应激的影响

与mock组比较，4和8 h异氟醚组细胞的GRP78及caspase- 12的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.05)，1 h异氟醚组变化不明显(图4)。各组中的CHOP的mRNA和蛋白水平无明显变化。并且，4和8 h异氟醚组细胞的caspase- 3的剪切体比例降低。

*P<0.05 compared with 1 hour treated group； △P<0.01 compared with 1 hour treated group图4 异氟醚诱导的HK- 2细胞低氧/复氧模型内质网应激的标志蛋白GRP78，CHOP和caspase- 12的mRNA和蛋白水平变化Fig 4 Effect of isoflurane on GRP78, CHOP, caspase- 12 mRNA and protein levels in HK- 2 cell line induced by ER hypoxia/reoxygenation

3 讨论

手术造成的缺血再灌注损伤发生机制复杂。肾小管上皮细胞具有丰富的内质网结构，在缺血再灌注过程中，细胞内堆积大量氧自由基，引起Ca2+浓度失衡、内质网功能障碍并激发ERS[5]。ERS对细胞起双向调节作用。适度的ERS可以调节钙离子浓度平衡、修复未折叠蛋白及回复内质网正常分泌功能；而过度ERS则可通过诱导细胞凋亡，加重缺血再灌注损伤[6]。因此，内质网应激的调控对缺血再灌注损伤的控制关系密切[7]。

本研究发现，异氟醚对肾小管上皮细胞HK- 2的低氧/复氧模型具有保护作用。与未处理组相比，低氧/复氧模型HK- 2细胞凋亡率明显增高，LDH增高，细胞增殖减少，说明低氧/复氧处理造成了细胞损伤及凋亡增加。异氟醚可以明显减少LDH含量，加速细胞的增殖。提示异氟醚可以缓解低氧/复氧处理对HK- 2细胞的损伤。Annexin V/PI荧光双标进一步确认了异氟醚的处理可以减缓低氧/复氧对HK- 2细胞的凋亡作用。RT-qPCR和半定量Western blot结果显示，低氧/复氧处理促进了ERS，并诱导细胞凋亡。Caspase- 12的表达量增加进一步说明，低氧/复氧处理引起的细胞凋亡是通过ERS诱发的。异氟醚对低氧/复氧模型肾小管上皮细胞系的保护作用可能是通过调控ERS引起的细胞凋亡实现的。造模后短时间异氟醚对细胞凋亡无影响，而较长时间则明显降低细胞凋亡，说明异氟醚对ERS的调控需要时间累积。而长时间异氟醚暴露并未明显降低ERS，提示异氟醚的作用可能是直接抑制ERS引起的细胞凋亡通路。