内皮间质转化参与阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化

邓飞艳，谢路远，詹世斌，刘志燕，薛 蕾，高妮娜，盛小伍*

(1.湖南省肿瘤医院/中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院 中心实验室，湖南 长沙 410000； 2.南华大学， 湖南 衡阳 421001)

阿霉素(doxorubicin，Dox)是使用最广泛的蒽环类抗肿瘤药物，疗效显著，但因具有严重心脏毒性，临床应用受限[1-2]。阿霉素与心肌组织亲和力较高，引起心肌细胞内氧自由基产生增多、清除减少及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF-α)等炎性因子的产生增多[1]，导致心肌细胞凋亡和坏死[2-4]，最终心肌细胞被纤维组织取代[5]，形成以肌成纤维细胞增多为特点的心肌纤维化[6]。最近研究表明内皮间质转化(endothelial mesenchymal transition，EMT)是肌成纤维细胞的重要来源[7-8]。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)是重要的促纤维化因子，在纤维化疾病中产生增加，可诱导EMT生成肌成纤维细胞[6-9]。目前阿霉素心肌纤维化机制仍未阐明。本实验旨在研究EMT在阿霉素心肌纤维化形成中的作用，为阿霉素心脏病的防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级SD大鼠，雌雄各24只，质量(220±20)g(湖南斯莱克景达实验动物有限公司，质量合格证编号:43004700030496)。

1.1.2 主要试剂：注射用盐酸多柔比星(深圳万乐药业有限公司)；Masson试剂盒(BASO公司)；HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技公司)；α-SMA抗体和vWF抗体(Abcam公司)；Trizol、反转录试剂盒和real-time PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组及处理：将大鼠随机分成对照组和阿霉素1、2、6周3组(DOX-1、2和6周)，每组12只，雌雄各半。实验前适应饲养1周，观察大鼠的活动、进食及大小便情况，确保大鼠健康状态良好。对照组(每周腹腔注射0.9%氯化钠溶液1 mL/kg，每周1次，连续6周)。阿霉素组(每周腹腔注射阿霉素2 mg/kg[10]，每周1次，连续6周)。分别于1、2和6周处死大鼠，检测心肌纤维化相关指标及心肌组织血管内皮间质转化指标。

1.2.2 HE染色和Masson三色染色检测心肌组织病理形态学改变：按说明书操作。

1.2.3 RT-qPCR检测纤维化相关基因Col1α、Col3α、TGF-β1 mRNA表达：应用NCBI Primer-Blast设计引物。提取大鼠心肌组织RNA，并测定其含量。反转录试剂盒合成cDNA。以GAPDH作为内参，检测纤维化相关基因Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA的表达水平。引物序列(表1)。

1.2.4 免疫组织化学法检测心肌组织TGF-β1表达：采用EnVision两步法对心肌组织进行免疫组织化学染色。以4%中性甲醛液固定心肌组织，石蜡包埋，4 μm厚度切片。以TGF-β1抗体作为一抗，滴加一抗后室温孵育1 h，之后用EnVision两步法试剂盒室温孵育40 min，最后用DAB显色剂显色5 min，苏木素复染细胞核，脱水、透明、封片。

1.2.5 免疫荧光染色检测心肌组织EMT现象：所有心肌组织均以4%中性甲醛液固定，石蜡包埋，4 μm厚度切片。免疫荧光双染，同时孵两种一抗(兔抗vWF、鼠抗α-SMA)，4 ℃过夜后冲洗3遍。随后37 ℃孵育两种二抗(羊抗兔 Alexa、羊抗鼠Alexa)，DAPI复染细胞核，封片荧光显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠一般情况

腹腔注射阿霉素后，约1/3的大鼠因急性心律失常死亡。所有大鼠出现毛发稀少，腹部膨隆，精神不好,活动差。1和2周组大鼠心包积液,6周组大鼠心包积液、腹腔积液明显。

表1 实时定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences of real-time PCR

2.2 阿霉素对心肌形态学的影响

阿霉素6周组大鼠心腔明显扩大、心室壁变薄(图1A)。心肌纤维排列紊乱，心肌间隙明显增宽，心肌纤维溶解和坏死(图1B红色箭头所示)，心肌细胞间隙有中性粒细胞及单核、淋巴细胞浸润(图1B黄色箭头所示)，血管周围有大量纤维组织围绕(图1B蓝色箭头所示)。

A.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under naked eyes; B.HE staining for doxorubicin induced cardiac fibrosis under microscope

图1阿霉素诱导心肌纤维化形态
Fig1Morphologyofdoxorubicin-inducedmyocardialfibrosis

2.3 阿霉素对心肌间质及血管周围胶原面积的影响

阿霉素1、2、6周组血管周围和心肌间质中胶原纤维组织增多，血管内皮排列不规则，血管内红细胞减少(图2A)。阿霉素1周组大鼠心肌间质及血管周围胶原面积高于对照组(P<0.05)，阿霉素2和6周组大鼠心肌间质及血管周围胶原面积显著高于对照组(P<0.01)(图2B)。

2.4 阿霉素对心肌Col1α、Col3α和TGF-β1 mRNA表达的影响

细胞外基质的过量产生和沉积是心肌纤维化的主要特点。纤维化组织中胶原纤维的主要成分为I型胶原和III型胶原。阿霉素2和6周组大鼠心肌组织Col1αmRNA的表达高于对照组(P<0.05)(图3A)。阿霉素2和6周组大鼠心肌组织Col3αmRNA的表达高于对照组(P<0.05)(图3B)。阿霉素6周组大鼠心肌组织TGF-β1 mRNA的表达高于对照组(P<0.05)(图4A)。

2.5 阿霉素对心肌TGF-β1蛋白表达的影响

TGF-β1阳性表达呈棕黄色颗粒状，位于细胞质中。对照组大鼠心肌组织TGF-β1表达很少(图4B，阿霉素1周组表达较少(图4C)，阿霉素2周组表达较多(图4D)，阿霉素6周组表达明显增多(图4E)。

2.6 阿霉素对心肌EMT的影响

对照组心肌组织中未见vWF和α-SMA共染的现象，阿霉素1、2和6周组心肌组织中可见明显vWF和α-SMA共染的现象(图5)。

3 讨论

阿霉素心脏毒性以不可逆转的心肌病和充血性心力衰竭为主， 其心肌病理改变复杂。既往研究表明阿霉素介导的心脏病患者以扩张型心肌病为主，而青少年阿霉素毒性患者常伴有限制型心肌病[11]。本研究发现成年SD大鼠腹腔注射阿霉素后心脏出现心室腔明显扩大、心室壁变薄等扩张型心肌病的表现。随着阿霉素剂量的累积，心肌纤维化面积增加，而心肌纤维化可以导致心脏变硬，心力衰竭患者常伴有心肌纤维化，提示改善心肌纤维化有益于阿霉素心脏病的治疗。在阿霉素心肌纤维化模型中发现，心肌血管周围围绕大量纤维组织，并且血管内皮细胞损伤，血管通透性增加。血管内皮转化可能参与阿霉素心肌纤维化形成的机制。在纤维化疾病中，静息状态的成纤维细胞激活和增殖被认为是成肌纤维细胞的主要来源。EMT自从被提出也是成肌纤维细胞的来源之后，一系列的动物模型和人体纤维化疾病研究表明EMT参与心脏、肺、肾脏和放射性纤维化疾病的形成[6,12-13]。

A.Masson trichrome staining for fibrosis collagen in cardiac cross sectional parts; B.the ratio of fibrotic area to cardiac gross area of each Masson trichrome staing image in each group;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group

A.Col1α mRNA expression level; B.Col3α mRNA expression level; *P<0.05 compared with control group图3 阿霉素诱导心肌纤维化相关基因的表达Fig 3 Doxorubicin-induced cardiac fibrosis-related gene

A.TGF-β1 mRNA expression level；B.TGF-β1 protein expression level in control group；C.TGF-β1 protein expression level in Dox-1 week group；D.TGF-β1 protein expression level in Dox-2 weeks group；E.TGF-β1 protein expression level in Dox-6 weeks group;*P<0.05 compared with control group

Immunostaining of cardiac tissue in control and doxorubicin 1,2 and 6 weeks groups, red part indicated vWF staining positive, green part indicated α-SMA staining positive; the green arrow showed yellow part which means vWF and α-SMA coexpression and positive

图5阿霉素诱导了心肌纤维化中EMT的形成
Fig5DoxorubicininducedtheformationofEMTinmyocardialfibrosis(×100,×400)

本研究发现，腹腔注射阿霉素后，许多血管内皮细胞表达内皮细胞标志vWF的同时也表达间质标志α-SMA，而对照组大鼠心肌血管内皮细胞未出现此现象。血管内皮细胞同时表达vWF和α-SMA说明血管内皮细胞正在向间质细胞转化。本研究证实血管内皮通过EMT参与阿霉素心肌纤维化的形成，抑制内皮间质转化可能成为阿霉素心脏病的治疗靶点。

综上所述，阿霉素可诱导大鼠不可逆的心肌纤维化，内皮间质转化可能参与阿霉素所致的心肌纤维化的形成。