基于整合药理学平台的六味地黄丸治疗糖尿病的分子机制研究

张佳琪，唐仕欢，李德凤，张 毅，苏 瑾，刘 杨，张艾嘉，王 萍,，王喜军

(1.黑龙江中医药大学国家中医方证代谢组学研究中心，哈尔滨 150040；2.中国中医科学院中药研究所，北京 100700)

六味地黄方最早出自宋代钱乙所著的《小儿药证直诀》一书，由熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻6味药组成[1]，是滋阴补肾的中医经典名方。六味地黄丸具有“三补三泻”的特点：熟地黄滋阴补肾，泽泻利水渗湿，泻肾水；山茱萸温涩肝经，牡丹皮凉肝泻火；山药健脾固肾，茯苓渗湿健脾。六味合用，为“三补三泻”之良剂，滋阴补肾之名方[2]。主要用于肾阴虚引起头晕耳鸣，腰膝酸软，骨蒸潮热，盗汗遗精，消渴等症状。近年来，除了其传统的滋阴补肾应用外，还对糖尿病、高血压、抗肿瘤、更年期综合征等有大量的临床应用报道[3-5]。

糖尿病属中医“消渴”范畴，而消渴多以阴虚为本，六味地黄丸具有较好的滋阴补肾和降低血糖的作用，在治疗糖尿病方面应用最为广泛且取得了较大的进展，方中各药均有降糖的功效，疗效确切[6-8]。但由于中药复方的复杂性，其治疗糖尿病的分子机制尚未得到完全阐释。

中药复方是中医临床治疗的主要方法和手段，以多成分作用于多靶点产生药效，探索中药复方的化学物质实体和与机体生命活动的交互规律，科学地阐释复方药效的科学内涵，是中医药理论研究的难点，也是中医药理论研究的关键科学问题。中药整合药理学以多学科交叉融合为基础，广泛应用到中药有效成分辨识、配伍理论、分子机制等方面[9]。整合药理学强调宏观与微观、整体与局部、体内ADME过程与活性评价、虚拟计算与实验验证的整合，拟解决的关键问题之一就是探索中药复方的化学物质实体与机体相互作用规律，系统阐释中药复方的药效物质基础，为临床用药提供科学依据[10]。

为进一步发展整合药理学研究新方法和技术，完善研究体系，拓展其在中医药领域的应用，中国中医科学院中药研究所联合北京大学药学院、中国科学院相关机构构建中药整合药理学平台(http://www.tcmip.cn/)。中药整合药理学平台是以中医药大数据(中药成分数据库、中药材数据库、中药方剂数据库、疾病症状靶标数据库)为基础，以人工智能、数据模建和挖掘、网络科学等为技术手段，在中药药效物质基础、分子机制探讨、质量控制、中药新药研发以及中药临床精准用药等方面有较好的应用，通过建立“中药方剂-化学成分-作用靶标-疾病靶标”多维度关联的有效工具，揭示中药药效物质基础及其分子机制，为揭示中医原创思维的科学价值和名医经验传承提供技术支撑[11]。

本研究借助整合药理学平台(http://www.tcmip.cn/)，探讨六味地黄丸治疗糖尿病的药效物质基础及其分子机制，为六味地黄丸有效成分辨识及其质量控制、分子机制与临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 化学成分来源

在整合药理学平台(http://www.tcmip.cn/)，收集中药材“地黄”“山药”“山茱萸”“茯苓”“泽泻”“牡丹皮”的所有化学成分，建立六味地黄丸的化学成分数据库。

1.2 候选靶标来源

在整合药理学平台疾病/证候靶标数据库，以“diabetes mellitus” “diabetes”“diabetic”作为疾病或症状关键词进行检索，勾选检索出来的所有靶标，作为候选的疾病靶标。

1.3 靶标预测

对中药靶标预测界面建立的化学成分库中的成分进行化学结构相似性对比，选取相似性分数大于等于0.8的成分预测靶标作为六味地黄丸作用的潜在靶标。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用信息(PPI)

六味地黄丸作用的潜在靶标与糖尿病疾病靶标之间的蛋白质-蛋白质相互作用信息(PPI)，通过整合药理学平台的PPI数据库获得，该平台镶嵌了HAPPI、Reactome、OPHID、InAct、HPRD、MINT、DIP、PDZBase等数据库中蛋白质-蛋白质相互作用数据。

1.5 网络构建与分析

通过整合药理学平台网络分析模块，针对六味地黄丸作用的潜在靶标与糖尿病疾病靶标之间的蛋白质-蛋白质相互作用信息计算网络特征值，以“节点连接度(degree)”的2倍中位数为卡值，选取中药靶标-疾病基因互作网络的核心节点(hubs)；在此基础上，以“degree”“节点紧密度(closeness)”和“节点介度(betweenness)”的中位数为卡值，选取同时满足3个卡值的节点为中药方剂矫正疾病失衡网络的关键靶标网络。然后，对关键靶标网络进行通路富集分析，选取P-Value前30的通路，构建“中药方剂-中药材-化学成分-核心靶标-关键通路”的多层次关联网络，并对关键靶标网络和多层次关联网络进行可视化。

1.6 基因功能和通路富集分析

基因功能和通路富集分析在整合药理学评价进行，相关信息来自于GO数据库(http://www. geneontology.org)和KEGG通路数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, http://www.genome.jp/kegg/)。

2 结果与分析

2.1 六味地黄丸化学成分靶标预测

地黄收集化学成分38个共预测出690个靶标，山茱萸收集化学成分72个预测出774个靶标，山药收集化学成分61个预测出1 091个靶标，牡丹皮收集化学成分15个预测出11个靶标，茯苓收集化学成分33个预测出747个靶标，泽泻收集化学成分31个预测出117个靶标，各味中药共有靶标情况见表2。

表1 “中药-成分-靶标”基本信息Tab.1 The information of traditional Chinese medicine-compound-taget

地黄主要化学成分有环烯醚萜及其他糖苷类、氨基酸、微量元素等，已有研究表明，地黄寡糖可以降低糖尿病大鼠的血糖血脂水平[12]，而且对高胰岛素诱发的HepG 2细胞胰岛素抵抗具有明显改善作用[13]。

山茱萸主要化学成分有环烯醚萜类、鞣质类、黄酮类等，有文献报道山茱萸总萜可通过抑制α-葡萄糖苷酶减少糖类吸收，通过非胰岛素依赖途径发挥其降糖作用[14-15]，山茱萸环烯醚萜总苷可显著抑制AGEs诱导的大鼠肾系膜细胞炎症反应，对糖尿病肾病也具有一定保护作用[16]。

山药主要化学成分有皂苷、糖、蛋白质、鞣质、多种氨基酸等，山药最主要的药用成分是山药多糖，目前已有研究表明山药多糖具有修复和保护胰岛细胞的作用，并且能够降低显著血清中胰高血糖素水平[17]。

牡丹皮主要化学成分有丹皮酚、丹皮酚苷类、黄酮类、多糖、鞣质等，有文献报道牡丹皮多糖可显著降低2型糖尿病大鼠的空腹血糖，改善糖耐量降低[18]，牡丹皮苷/酚可通过抑制TGF-β1诱导的Smad2/3，P38MARK通路活化从而达到对糖尿病肾病大鼠肾损伤的保护作用[19]。

茯苓主要化学成分有茯苓多糖、三萜类化合物甾醇、脂肪、腺嘌呤等，其中茯苓多糖能有效降低Ⅱ型糖尿病小鼠血糖、血清胰岛素和胰高血糖素水平，并且对糖尿病引起的脂质代谢紊乱有一定改善作用[20]。

泽泻主要化学成分5种三萜类化合物，另有挥发油、小量生物碱、天门冬素、甾醇、脂肪酸、蛋白质等，已有文献报道泽泻具有能够降低大鼠空腹血糖，调节糖、脂代谢，从而达到治疗糖尿病的功效[21-22]。

2.2 六味地黄丸治疗糖尿病的核心靶标网络、基因功能和通路富集分析

2.2.1 核心靶标网络分析

通过整合药理学分析的网络分析模块，基于PPI相互作用数据库，构建六味地黄丸药物组合潜在靶标与疾病靶标相互作用网络。根据条件筛选出关键靶标232个，根据Degree值图1仅显示前100个靶点，图中节点的大小与Degree值成正比关系，其中核心组合化学成分直接作用节点55个，疾病靶点14个。

图1 六味地黄丸调节糖尿病候选靶标网络图Fig.1 The network of LiuweiDihuang candidate targets for diabetes mellitus Red.Putative Drug Target; Yellow. Known Disease Target; Gray. Others

从图1中可以看出，疾病和药物虽然无共同靶点，但14个疾病靶点与多个药物靶点相关联。有研究表明PRKCB基因编码的蛋白激酶C-β通过PKC信号通路在糖尿病及其并发症中起着重要的作用[23]，动物实验发现蛋白激酶C-β缺陷小鼠可以避免高血糖引起的肾功能障碍、氧化应激及微量白蛋白尿的损害[24]，使用蛋白激酶C-β抑制剂，可以改变糖尿病患者的血流动力学，减少细胞外基质积聚、降低肾小球滤过率及微量白蛋白尿，预防高血糖诱导的氧化应激，改善糖尿病大鼠高血糖诱导的心肌细胞肥大，LVH和舒张功能障碍[25]，推测六味地黄丸可通过抑制蛋白激酶C活性治疗糖尿病。α-葡萄糖苷酶(GAA)等酶通过参与调控糖代谢环节引发糖代谢异常，是引发糖尿病的主要病理因素之一，临床常使用α-葡萄糖苷酶抑制剂抑制α-葡萄糖苷酶活性，降低糖尿病患者体内血糖水平，治疗糖尿病[26]。血小板源生长因子受体(PDGFR)在糖尿病足创面愈合方面起着重要作用，国内有学者对糖尿病患者和正常患者皮肤进行研究发现，糖尿病患者皮肤溃疡组织PDGFR-α和PDGFR-β与正常患者相比表达显著下降[27]。药物靶标中有葡萄糖激酶(GCK)，葡萄糖激酶参与糖代谢的各个途径，是糖代谢途径中的关键酶，能够通过增加胰岛素的释放和促进肝脏葡萄糖的利用来降低血糖，对维持血糖稳态起重要作用[28-29]，推测六味地黄丸可能通过促进胰岛细胞分泌葡萄糖激酶达到治疗糖尿病的效果。六味地黄丸还作用于PLCD1、PLD1、PLD2、PLA2G2D等药物靶标，与糖尿病肾病相关的一个很重要的机理是蛋白激酶的活化，蛋白激酶活化会导致磷脂代谢紊乱，蛋白激酶通路的活化将引起磷脂酶A2活性升高，磷脂酶A2是体内重要的磷脂酶，催化磷脂裂解产生游离得花生四烯酸。所以糖尿病肾病体内的磷脂水平和病理直接相关[30]，磷脂酶D也可通过激活蛋白激酶C在糖尿病及其并发症起作用[31]，推测六味地黄丸对糖尿病及其并发症引起的磷脂代谢紊乱具有一定的调节改善作用。

2.2.2 基因功能分析

通过GO和KEGG数据库的基因和功能分析，六味地黄丸药物靶标与疾病靶标基因功能分析结果显示有ATP结合、线粒体等与能量代谢有关的条目，推测糖尿病可能与能量代谢有关联。查阅文献得知糖尿病常常伴随着能量代谢紊乱，糖尿病大鼠与正常大鼠相比ATP合成显著下降，Na+-K-ATP酶活性显著降低[32]。黄连素通过抑制线粒体的功能，激活AMPK信号通路来改善胰岛素抵抗[33]。此外，六味地黄丸还与蛋白激酶活性有关，进一步证明六味地黄丸可通过抑制蛋白激酶C活性治疗糖尿病。基因功能分析结果显示还具有谷氨酸受体信号通路、谷氨酸结合等氨基酸相关的多个条目(见表3)。

表3 六味地黄丸治疗糖尿病关键靶标基因功能信息Tab.3 The target functional information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

2.2.3 通路富集分析

通过整合药理学平台进行靶标通路富集分析，关键通路根据P-Value值仅显示前30条通路，靶标通路富集分析结果显示主要集中丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、VEGF信号通路、Ras信号通路、钙信号通路、TRP通道的炎症介质调节等信号通路以及乙型肝炎等疾病相关通路(表4)。

2.3 中药方剂治疗疾病“核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图

图2可看出相关通路主要有丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢等多个氨基酸代谢通路以及血管内皮细胞生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)，Ras信号通路(Ras signaling pathway)，钙信号转导通路(Calcium signaling pathway)等多种信号通路。氨基酸可通过三羧酸循环参与糖脂代谢，影响着Ⅱ型糖尿病的发生发展，有研究证明Ⅱ型糖尿病大鼠会发生严重的氨基酸代谢紊乱，丙氨酸、谷氨酰胺和精氨酸水平下降，促进炎症反应，降低胰岛素敏感性[34]。有研究表明通过调节Ras信号通路阻断VEGF介导的糖尿病肾病可以显著降低动物模型的肾小球超滤和白蛋白尿[35]。这些通路相关的核心靶标60个，与71个六味地黄丸化学成分相关联，方中各药在治疗糖尿病中均发挥了重要作用。

表4 六味地黄丸治疗糖尿病关键靶标通路信息Tab.4 The target pathway information of LiuweiDihuang Pills on the diabetes mellitus

图2 中药方剂治疗疾病”核心成分-关键靶标-主要通路”多维网络关系图Fig.2 The “compound-target-pathway” network of LiuweiDihuang Pills. Green.Triditional Chinese medicine; Purple.Compound; Blue. Target;Red.Pathway

3 结论

由于中药复方具有成分复杂，配伍灵活，作用于多靶点，能够干预多条信号通路的特性，因此难以全面描述其与人体的作用规律，这也成为制约当前中药发展的瓶颈问题。中药整合药理学计算平台以中医药大数据(中药方剂数据库、中药材数据库、中药成分数据库、疾病症状靶标数据库)为支撑，以人工智能、数据挖掘、网络科学等为手段，构建满足个体需求的自助式服务平台。通过建立“中药方剂-化学成分-作用靶标-疾病靶标”多维度关联的有效工具，有效揭示了中药药效物质基础及其分子机制，为中药及中药复方的研究提供更多的参考。本研究借助中药整合药理学计算平台，分析六味地黄丸治疗糖尿病的作用物质基础及其分子机制，发现多种成分的靶点如PRKCB、GAA、GCK等与糖尿病相关联，推测其可能通过调节丙氨酸、谷氨酸代谢等氨基酸代谢、能量代谢及糖脂代谢等多种代谢紊乱治疗糖尿病。

六味地黄丸治疗糖尿病已经取得了很好的疗效，对其分子机制及发挥作用的药效物质基础进行研究可以为六味地黄丸及其所含中药成分的进一步研究提供依据，也可以为糖尿病的临床治疗提供借鉴与参考。本研究是基于整合药理学平台的预测，具体机制及物质基础还需通过实验加以验证，相信本研究能够为六味地黄丸的进一步研究及糖尿病的治疗工作的开展提供一些有益的参考。