火把花根对糖尿病肾病大鼠肾脏Angptl2和NF-κB表达的影响

方玲娜，卢 冰，张 莉，沈莉雯，沈鲜安，朱文华，严 言，唐枫燕，钟 绍

(江苏大学昆山医院，江苏 昆山 215300)

糖尿病肾病是常见的糖尿病慢性并发症，多种细胞因子和炎症因子参与其发病和发展[1]。血管生成素样蛋白2(Angptl2)是血管生成素样蛋白之一，在心脏、肾脏、脂肪等组织表达，能够促进内皮细胞出芽[2]，与血管生成有关，且其参与炎症反应，是炎症反应通路中的递质[3]；而核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是炎症反应通路中重要的调节因子。火把花根具有抗炎、抗免疫作用，本研究通过观察火把花根对糖尿病肾病大鼠蛋白尿及肾脏组织中Angptl2和NF-κB的影响，探讨了火把花根对糖尿病肾病的保护作用，现报道如下。

1 实验资料

1.1实验动物 8周龄Wistar雄性大鼠40只，体质量(200±10)g，购于常州卡文斯实验动物有限公司，动物合格证号：SYXK(苏)2011-0003。

1.2药物及试剂和仪器 火把花根粉(陕西斯诺特生物技术有限公司)，厄贝沙坦片(安博维，Sanofi-anvitis公司，法国)。链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美国)，PAS染液试剂盒(南京建成科技公司)，一抗兔抗大鼠Angptl-2和兔抗大鼠NF-κB抗体(abcam公司，英国)，二抗羊抗兔抗体(abcam公司，英国)，倒置显微镜(Leica公司，德国)，透视电镜(JEOL公司，日本)。

1.3实验方法 Wistar大鼠适应性喂养7 d，从中随机取10只作为正常组，其余大鼠空腹一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液，pH 4.4)制备糖尿病肾病模型，以尿蛋白试纸测尿蛋白()为造模成功。将造模成功的27只大鼠随机分为安慰剂组、厄贝沙坦组和火把花根组，每组9只，室温下标准饲料饲养，自由饮水，4周后，厄贝沙坦组和火把花根组分别灌胃厄贝沙坦50 mg/kg、火把花根4 g/kg(参照文献[4]中给药剂量)，正常组和安慰剂组灌胃等量蒸馏水，均1次/d，干预8周。

1.4标本收集与指标测定 将大鼠置于代谢笼内留取24 h尿液，测定各组灌胃后每周尿蛋白水平。灌胃结束后处死大鼠，取肾脏。

1.4.1肾脏组织病理观察 ①取部分肾脏组织经甲醛固定，石蜡包埋后切片，脱蜡，水洗后分别进行PAS和HE染色，光镜下观察各组肾脏组织的病理改变。②取部分肾脏组织用5%戊二醛固定，常规脱水、包埋、切片，采用JEM1230透视电镜观察。

1.4.2肾脏组织中Angptl2和NF-κB表达检测采用二步法，肾组织石蜡切片脱蜡水化，固定后通过3% H2O2/PBS灭活内源性过氧化物酶，PBS漂洗后浸入柠檬酸盐缓冲液修复，5%BSA封闭，加入稀释后一抗(稀释比例1∶100)4 ℃过夜孵育，洗片后再加入稀释后二抗(稀释比例1∶1 000)37 ℃孵育1 h，DAB显色后滴加苏木素复染，中性树胶封片。采用Image-Pro Plus图像分析系统计算视野中Angptl2和NF-κB的光密度值，计算平均值。

2 结 果

2.1各组大鼠尿蛋白水平比较 灌胃第1周，安慰剂组、厄贝沙坦组和火把花根组尿蛋白水平均明显高于正常组(P均<0.05)。第2周厄贝沙坦组和火把花根组尿蛋白水平均开始下降，均明显低于安慰剂组(P均<0.05)，但灌胃前4周厄贝沙坦组和火把花根组尿蛋白水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；第5周火把花根组尿蛋白水平明显低于厄贝沙坦组(P<0.05)；第7周和第8周，厄贝沙坦组和火把花根组尿蛋白水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

2.2各组大鼠肾脏组织PAS染色表现 安慰剂组糖原颗粒沉着较多，厄贝沙坦组和火把花根组减少。见图1～4。

2.3各组大鼠肾脏组织HE染色表现 安慰剂组肾小球体积肥大呈肿胀状态，肾小囊腔狭窄，呈裂隙状，肾小管上皮细胞排列紊乱、肥大；厄贝沙坦组基底膜轻度增厚，系膜基质轻度增生；火把花根组仅见系膜基质轻度增加。见图5～8。

表1 各组大鼠每周尿蛋白水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与安慰组比较，P<0.05；③与厄贝沙坦组比较，P<0.05。

图1 正常组大鼠肾脏组织PAS染色表现(×400)

图2 安慰剂组大鼠肾脏组织PAS染色表现(×400)

图3 厄贝沙坦组大鼠肾脏组织PAS染色表现(×400)

图4 火把花根组大鼠肾脏组织PAS染色表现(×400)

图5 正常组大鼠肾脏组织HE染色表现(×400)

图6 安慰剂组大鼠肾脏组织HE染色表现(×400)

图7 厄贝沙坦组大鼠肾脏组织HE染色表现(×400)

图8 火把花根组大鼠肾脏组织HE染色表现(×400)

2.4各组大鼠肾脏组织透视电镜表现 安慰剂组大鼠肾小球毛细血管襻官腔扩张明显，基底膜呈阶段性增厚，足细胞足突排列紊乱、增宽、节段性融合；厄贝沙坦组和火把花根组大鼠肾小球病变程度及范围相对减轻。见图9～12。

图9 正常组大鼠肾脏组织透视电镜表现(×1 700)

图10 安慰剂组大鼠肾脏组织透视电镜表现(×1 700)

图11 厄贝沙坦组大鼠肾脏组织透视电镜表现(×1 700)

图12 火把花根组大鼠肾脏组织透视电镜表现(×1 700)

2.5各组大鼠Angptl2和NF-κB表达水平 安慰剂组Angptl2和NF-κB表达水平均明显高于正常组(P均<0.05)；厄贝沙坦组和火把花根组Angptl2和NF-κB表达水平均明显低于安慰剂组(P均<0.05)。厄贝沙坦组和火把花根组Angptl2表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，火把花根组NF-κB表达水平明显低于厄贝沙坦组(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠Angptl2和NF-κB表达水平比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与安慰组比较，P<0.05；③与厄贝沙坦组比较，P<0.05。

3 讨 论

糖尿病属于中医“消渴”范畴，消渴并发“水肿”“水病”和“尿浊”等与糖尿病肾病相近，并认为“气阴两虚”是消渴肾病的重要病机[5]。中医治疗糖尿病肾病主要使用益气滋阴、活血化瘀类药物，常见的药物有黄芪、雷公藤等。火把花根含有雷公藤碱、雷公藤内酯等多种成分，临床上常用火把花根提取物治疗自身免疫性疾病如类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病[6-8]。王丽娟等[9]研究发现，火把花根能够降低糖尿病肾病患者尿蛋白，可能与火把花根抑制TGF-β1、上调肝细胞生长因子，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化有关。

尿蛋白是糖尿病肾病发展的独立危险因素，尿蛋白的发生与足细胞损伤、肾小球血流动力学异常、肾小球肥大、系膜区基质的扩大等因素有关，足细胞数量和形态的改变是尿蛋白发生的重要因素[10-11]。郑敬民等[12]研究发现，糖尿病肾病小鼠足细胞内有Angptl2表达，提示足细胞产生分泌Angptl2。吴义超等[13]研究发现，糖尿病肾病患者Angptl2表达增加；Angptl2参与足细胞损伤，且与尿白蛋白成正相关[14-16]。本实验研究发现，火把花根有明显降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白的作用，在试验早期降低尿蛋白的作用较厄贝沙坦更为明显，且随着火把花根干预时间延长，大鼠尿蛋白呈线性下降；透视电镜显示安慰剂组足细胞足突排列紊乱、增宽，阶段性融合，丧失正常结构，厄贝沙坦组和火把花根组病变程度则相对减轻；免疫组化分析发现，火把花根组大鼠肾脏组织中Angptl2表达水平明显下降。提示火把花根可能通过抑制Angptl2表达保护足细胞，减少尿蛋白。

NF-κB存在于多种组织细胞中，是多信号转导通路的交叉点之一，它调控和参与机体应激、炎症反应。NF-κB能够调节包括足细胞在内的多种肾脏组织细胞表达和分泌炎症因子，而高血糖可激活NF-κB，从而上调IL-1β和TNF-α水平，在糖尿病肾病发生中起关键作用[17-18]。本实验研究发现，糖尿病肾病大鼠肾脏组织中NF-κB表达增加，与周谊夏等[19]观察结果相似；火把花根组中NF-κB表达明显减少，并且低于厄贝沙坦组，提示火把花根可通过抑制NF-κB表达减轻肾脏组织的炎症反应，延缓糖尿病肾病的进展，该作用可能较厄贝沙坦更为明显。

综上所述，火把花根能够降低糖尿病肾病大鼠尿蛋白水平，具有治疗糖尿病肾病的作用，该作用可能与其保护足细胞、抑制炎症反应有关，其中的信号通路需要进一步试验明确。