不同脱除卵丘细胞方式对牛体外胚胎生产效果的影响

2018-09-01韩永胜佟桂芝王洪宝李信涛

畜牧与饲料科学 2018年8期

韩永胜，佟桂芝，王洪宝，李信涛，宋斌

（1.黑龙江省畜牧研究所，黑龙江齐齐哈尔 161005；2.吉林省农业科学院，吉林长春 130000）

国外采用性控冻精进行体外性控胚胎生产的研究较早，目前囊胚率能达到50%左右［1-2］。我国在该领域研究起步较晚，但国内学者通过不断改善优化牛体外性控胚胎的生产体系，目前体外受精囊胚率已达到25%左右［3-5］。针对牛良种快速扩繁的实际需求及采用性控冻精体外受精生产性控胚胎效率较低、成本较高的现状，该试验系统比较了卵母细胞周围卵丘细胞的脱除方式对性控精液体外受精性控胚胎发育率的影响，旨在为提高体外性控牛胚胎生产效率提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

试验中所涉及的生化试剂除特别标注外均购自Sigma公司。

1.2 卵母细胞的收集

在牛屠宰场，用无菌剪刀剪取刚屠宰后牛的新鲜卵巢，用含1 000 IU/L青霉素和1 000 IU/L链霉素的灭菌生理盐水冲洗干净，放入含有双抗的32℃生理盐水中，在2 h内送回实验室。用无菌剪刀剪掉周围的脂肪等组织后用预热且加有双抗的生理盐水冲洗牛卵巢3次以上，用10mL带有12﹟针头的一次性注射器抽取卵巢上直径为2～8 mm卵泡的卵泡液，获得的卵泡液置于15 mL离心管内，放在预热至38.5℃的恒温台。分别取直径3.5 cm培养皿4个、直径9 cm培养皿2个，将直径9 cm培养皿底部划上宽度间隔约为0.7 cm的直线。将含有COCs的采卵液（15 mL离心管内）倒入培养皿中，并轻轻摇匀。然后在体视显微镜下收集卵丘—卵母细胞复合体（cumulus oocyte complex，COCs），并移入盛有抽卵液的直径3.5 cm培养皿中。形态正常、胞质均匀和卵丘细胞不低于3层的COCs为可用，用预平衡的卵母细胞成熟液清洗5次。采卵液配方：mPBS（0.665 g/L肝素钠、10%FBS、100 IU/L 青霉素、100 IU/L 链霉素）。

1.3 卵母细胞体外成熟

在体视镜下检出卵母细胞，然后选出A、B级卵母细胞，放入培养箱预平衡2 h以上，4孔培养板进行体外成熟（500 μL/孔），每孔放 50 枚 A、B级卵丘—卵母细胞复合体（COCs）。成熟液TCM-199［10 μg/mL 促性腺激素（FSH）、8%胎牛血清（FCS）、1 μg/mL 雌二醇（E2）、10 μg/mL 促黄体激素（LH）、1 mmol/L L-谷氨酰胺、20 ng/mL EGF、100 μmol/L半胱氨酸］，体外成熟24 h。培养条件为38.5℃、5%CO2、饱和湿度培养箱。

1.4 精子获能及体外受精

1.4.1 精子离心获能法：牛性控冷冻精液在38℃水浴中解冻15 s，然后将解冻后的精液贴壁缓慢加入获能液，然后进行离心（2 000 r/min，5 min），一次离心体外获能法在此时去上清液后，直接用受精液将精子密度稀释至1×106个/mL用于体外受精，性控精子体外获能液为BO液（10mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗坏血酸、3 mg/mL BSA）。

1.4.2 体外受精：受精前2 h做好受精液小滴，每滴50 μL，放入CO2培养箱中平衡。在精子处理的同时，用200 μL移液器反复吹打培养成熟的COCs，使卵子间相互分离。洗涤5次后，将20个COCs移入受精液滴中。然后将培养皿放入38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中进行体外受精。体外受精液为BO液（0.665 g/L肝素钠、10mg/L咖啡因、5 μmol/L 抗坏血酸、3 mg/mL BSA）。

1.5 体外胚胎发育培养（IVC）

1.5.1 胚胎发育液预平衡：在4孔培养板上标记组别、日期，每孔放入胚胎发育培养Ⅰ液600 μL，覆盖石蜡油。另取1.5 mL离心管，吸取1 mL的胚胎发育培养Ⅰ液放入离心管中，做好标记。将4孔培养板和离心管放入38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中，预平衡2 h。胚胎发育培养Ⅰ液配方：mCR1aa液+3 mg/mL BSA；胚胎发育培养Ⅱ液配方：mCR1aa液+10%FBS。其中，mCR1aa为 2%的必需氨基酸+1%的非必需氨基酸+2 mmol/L的谷氨酰胺。

1.5.2 脱除精子及卵丘细胞：精子与卵子受精培养8 h，将假定的受精卵移入mCR1aa液中洗涤3次，试验1组用吸管轻轻反复抽吸，以除掉卵丘细胞和黏附在受精卵上的精子；试验2组用0.1%透明质酸酶液处理5 min；对照组用振荡法将假定受精后的受精卵移入5 mL离心管（内装2 mL mCR1aa，已经预平衡 2 h），2 000 r/min、离心 5 min。根据试验设计分别用不同的方法脱除卵丘细胞。然后在胚胎发育培养Ⅰ液（预先在培养箱内平衡2 h）中洗涤3次后，然后按每滴50个卵子移入4 孔培养板 500 μL 的 IVC 液中，在 5%O2、5%CO2、90%N2，饱和湿度条件下进行早期胚胎体外培养。

1.5.3 更换培养液：受精卵于受精48 h统计胚胎卵裂率后转移至600 μL的胚胎发育培养Ⅱ液中继续培养，间隔2 d后半量换胚胎发育培养Ⅱ液。4孔培养板放入38.5℃、饱和湿度的5%O2、5%CO2、90%N2培养箱中培养。于受精第7～8天统计囊胚率。

1.6 数据处理

试验重复3次，试验数据用Excel 2003软件建立数据库进行数据整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，结果用平均值±标准差表示，以P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果与分析

由表1可知，体外受精8 h后，采用不同的脱除卵丘细胞方式（机械脱除法、酶脱除法、振荡法）脱除卵丘细胞，受精卵经体外培养后48 h统计胚胎卵裂率分别为（58.8±2.8）%、（58.5±5.7）%、（69.9±3.4）%，体外培养192 h统计囊胚率分别为（26.7±2.7）%、（26.9±3.9）%、（35.8±4.1）%。结果表明，振荡法显著优于机械脱除法和酶脱除法（P<0.05）。

3 讨论

卵丘细胞通过自分泌和旁分泌的方式影响牛体外受精效果［6-8］。在体外受精前，成熟卵母细胞部分脱除卵丘细胞组，体外受精胚胎卵裂率显著高于不脱除卵丘细胞组（P<0.05）。卵丘细胞在牛卵母细胞体外受精过程中有着许多重要作用，其中包括吸引、阻绊和选择精子［7-9］，活力弱的精子在其阻绊下一般很难接近卵母细胞。体外受精（IVF）培养8 h后，对照组卵丘细胞胚胎卵裂率、囊胚率显著高于试验2组（P＜0.05），且对照组的囊胚率最高，但与试验1组囊胚率相比差异不显著（P>0.05）。透明质酸酶作为商品化生物试剂，其生物活性不稳定，对贮存条件要求较高，消化卵丘细胞时易对卵母细胞造成伤害，且添加透明质酸酶后也需要机械人工吹打，如果吹打力度不够可能会导致不能轻易脱掉卵丘细胞，力度过大又会造成卵母细胞伤害或死亡；采取人工机械吹打脱除卵丘细胞，目前由于缺乏专业的操作装置，操作起来比较耗时且效率较低，操作时间过长时卵母细胞在外界操作环境时间就越长，容易造成卵母细胞大量死亡或者影响卵母细胞后期发育。该试验结果表明，对照组胚胎卵裂率显著高于试验2组（P＜0.05），且对照组的囊胚率最高，但与试验1组相比差异不显著（P>0.05）。这可能是因为在用0.1%透明质酸酶完全脱除卵丘细胞的过程中，对胚胎的透明带造成了损伤，进而影响了胚胎的卵裂率及囊胚的发育能力。该试验结果与赵学明等［4］的试验中，卵丘细胞完全脱除组的胚胎卵裂率（37.5±2.8）%显著低于卵丘细胞部分脱除组（67.0±4.7）%（P<0.05）结果相似。这可能是因为在用0.1%透明质酸酶完全脱除卵丘细胞的过程中，对卵母细胞的透明带造成了损伤，进而影响了卵母细胞的受精能力。