气管给药法检测甲醛对小鼠肺组织氧化损伤的研究

蒙 爱，任 帅，蒋 婕，陈 凤，张立娜

（东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

甲醛在人们的日常生活及居住环境中引起越来越多的关注。因其用途广泛，生产工艺简单，在家庭装修中使用于各种板制品中，是室内装修中主要的污染源之一［1］。当甲醛在室内达到一定浓度时，可引起眼部及咽喉不适、胸闷、头晕等神经系统反应。多项研究表明，甲醛对人体的皮肤黏膜具有强烈的刺激作用，且具有致敏、致突变的作用，对人及动物机体多个系统产生损伤，尤其对呼吸系统损伤较大［2-3］。甲醛对实验动物机体损害的研究较多，所采用的方法大多都是将实验动物置于一定的密闭空间中，在该空间内释放一定浓度的甲醛气体进行实验研究。该种研究方法的优点是可以模拟特定的居住环境，缺点是不能明确实验动物个体的甲醛吸入量。笔者以小鼠为研究对象，采用气管给药法，使液态甲醛直接进入小鼠呼吸系统，在明确小鼠个体甲醛吸入量的基础上，观察给予不同剂量液体甲醛对小鼠肺组织的影响，以期为探明甲醛对人体及动物肺组织氧化损伤的分子机理提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性成年BALB/c小鼠共30只，购自哈尔滨医科大学实验动物中心，体重约20 g，称重后随机分成3组，分别为低剂量组、高剂量组和生理盐水对照组。

1.2 主要试剂与仪器

组织匀浆机、酶标仪。SP-A含量、SOD活力及MDA含量检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。染毒试剂为40%甲醛。HE切片制作使用的乙醇为分析纯。

表1 甲醛对小鼠肺组织氧化应激指标的影响

图1 吸入液态甲醛对小鼠肺组织结构的影响（HE染色，100×）

1.3 试验方法

低剂量组：将原液用生理盐水稀释5 000倍后，每只小鼠给药终浓度为 0.2 mg/（kg·BW），给药终体积为16.5 μL；高剂量组：将原液用生理盐水稀释50倍后，每只小鼠给药终浓度为20mg/（kg·BW），给药终体积为16.5 μL；生理盐水对照组：每只小鼠给予生理盐水16.5 μL。

采用气管直接注入的方式进行染毒处理，按照设计的剂量每天对每只小鼠气管给药染毒1次，并在染毒后观察死亡情况，确定没有发生窒息及死亡现象后，连续染毒15 d。饲养期间给予正常饮水和饲料。各组小鼠连续饲养4周，采取折颈法处死。小鼠处死后，立即摘取其肺组织，肺左叶加入肺组织重量9倍的PBS溶液，放入组织匀浆机中冰浴匀浆5 min，取制备的组织匀浆液，按照试剂盒说明书测定氧化应激反应指标。采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）测定小鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）含量、肺组织SOD活力及MDA含量。肺右叶用4%多聚甲醛固定后，按照常规石蜡切片制作方法，逐步进行脱水、透明、包埋、切片后进行HE染色，制作成常规HE染色石蜡切片，在光镜下进行观察。

1.4 数据处理

试验数据以“平均值±标准差”表示，使用统计分析软件SPSS 19.0进行方差分析和显著性检验，P<0.05认为差异显著。

2 结果与分析

2.1 甲醛对小鼠肺组织氧化应激指标的影响

由表1可知，通过气管给药吸入不同剂量的甲醛溶液之后，小鼠肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）含量与生理盐水对照组相比呈现剂量依赖性下降趋势，高、低剂量组SP-A含量均显著低于生理盐水对照组（P<0.05），且高剂量组和低剂量组之间差异显著（P<0.05）；小鼠肺组织SOD活力同样呈现剂量依赖性下降趋势，高、低剂量组肺组织SOD活力均显著低于生理盐水对照组 （P<0.05），高、低剂量组之间差异不显著（P>0.05）；肺组织MDA含量与生理盐水对照组相比呈剂量依赖性上升趋势，高、低剂量组肺组织MDA含量均显著高于生理盐水对照组（P<0.05），且高剂量组和低剂量组之间差异显著（P<0.05）。

2.2 甲醛对小鼠肺组织结构的影响

由图1A可见，生理盐水对照组肺泡结构完整；由图1B、图1C可见，低剂量组和高剂量组的肺泡间组织膨大，肺泡间质细胞增多，且炎症细胞增多，发生炎性浸润。

3 讨论

随着人们环保意识的增强，甲醛污染问题也越来越突出，逐渐引起人们的重视，特别是家装行业带来的甲醛污染尤为突出。长时间处于甲醛污染物环境中会引起头晕、头痛、失眠和皮肤过敏等不同程度的神经以及脏器反应。甲醛经呼吸进入体内后，会对脏器组织造成不同程度的损伤［4］。Green等［5］研究证明活性炭颗粒能将甲醛直接带入呼吸道，且在呼吸道深部可以检测到。该研究采用气管染毒给药方式，可以保证液体甲醛直达小鼠气道深部，进入肺组织后，液体甲醛会对肺部细胞的正常生理结构造成损坏，进而影响其代谢及氧化应激反应。与传统的封闭厢式染毒方法相比，气管染毒法能够确保动物的吸入剂量是准确、可控的，同时，气管染毒法又可保证药物从气管吸入，直接到达气管和肺部，便于观察药物对肺部的直接损伤，保证试验效果。通过试验结果可以看到，经气管染毒方法给予甲醛的小鼠肺组织发生明显的炎性反应，有大量炎性细胞浸润，且引起肺泡内发生氧化应激反应。正常肺泡内干燥、无液体，甲醛染毒会引起大量间质细胞增生，分析原因可能是甲醛作为强氧化剂［6］，过量吸入可引起机体的氧化应激反应和细胞损伤［7］。Dallas 等［8］研究表明甲醛可引起肺部巨噬细胞染色体断裂，同时刺激皮质激素的释放，因此，可能导致肺毛细血管通透性增高，加速肺水肿的形成，激素含量测定的结果也间接验证了这一结果；同时，肺组织SP-A含量和SOD活力随着染毒剂量的增加呈现下降趋势。SOD作为生物体内重要的抗氧化酶，在清除自由基及防御中毒和肿瘤方面都有重要作用。MDA作为脂质过氧化物的重要降解产物，可以反映机体过氧化的程度。小鼠肺脏MDA含量随甲醛吸入剂量的升高而增加，提示随着甲醛吸入剂量的升高，其氧化损伤程度增加，已经超过了自身可以代偿的水平［9-10］。下一步笔者将继续探讨气管给药剂量的安全范围，从而为控制室内甲醛污染提供试验依据。