Vav3在小细胞肺癌组织中的表达及对细胞迁移和侵袭能力的影响

李大刚，李辉宗，康乐

（1.山东省临沂市人民医院东医疗区 呼吸内科，山东 临沂 276000；2.山东省蒙阴县中医院 内三科，山东 蒙阴 276200）

小细胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）作为肺癌常见类型之一，约占原发性肺癌的20%左右[1]，由于该肿瘤侵袭力强、生长迅速且易早期转移，多数患者临床确诊时已处于中晚期，尽管该肿瘤细胞对放化疗敏感，但治愈率较低，多数患者治疗后仍会复发或转移，预后较差，5年生存率低于10%[2]。因此，积极探讨影响SCLC高侵袭、转移的相关机制对改善患者预后具有重要意义。Vav3作为原癌基因Vav家族重要成员，在多种恶性肿瘤组织中呈高表达[3]，与肿瘤发生、转移过程密切相关，在肿瘤细胞黏附、凋亡、迁移、侵袭中发挥关键性作用[4]。本研究通过检测SCLC组织中Vav3表达，探讨其与患者临床病理特征之间的关系及对预后的影响，并利用小分子RNA干扰（small RNA interference,siRNA）技术抑制人小细胞肺癌H446细胞株，观察其对细胞迁移和侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 一般研究

1.1.1 临床资料 选取2012年2月-2016年3月在临沂市人民医院东医疗区治疗且临床资料完整的SCLC患者87例，均经支气管镜、穿刺或手术获取病理标本并明确诊断为单纯性SCLC，术前均未接受放化疗。其中，男性46例，女性41例；年龄33～79岁，平均（59.2±12.4）岁；临床分期：局限期43例，广泛期44例；61例具有吸烟史，40例发生远处转移。所有患者出院后均进行随访，方式包括门诊和电话，随访截止2017年3月31日，未出现失访病例，存活36例，死亡51例。另留取同期因肺外伤行手术治疗的正常肺组织50例作为对照组，均排除恶性肿瘤患者。其中，男性29例，女性21例；年龄31～78岁，平均（60.1±12.9）岁。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂和设备 免疫组织化学（简称免疫组化）试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司，兔抗人Vav3多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，人小细胞肺癌H446细胞株购自美国ATCC公司，DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，Vav3、内参引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，siRNA-Vav3、siRNA-对照序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成，LipofectamineTM2000转染试剂、Trizol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录、PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，Transwell小室购自美国Costar公司，实时荧光定量PCR仪（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）购自美国ABI公司，恒温培养箱购自常州迈科诺仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 组织中Vav3蛋白表达的检测 取SCLC和对照组组织，甲醛固定、石蜡包埋、切片，厚度约4 μm，用二甲苯脱蜡，经梯度酒精脱水，用3% 过氧化氢H2O2浸泡10 min以消除内源过氧化物酶影响，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）冲洗3次，置于枸橼酸（pH 6.0）液中煮沸15 min，用1%血清工作液封闭，室温孵育25 min。加入一抗兔抗人Vav3多克隆抗体（稀释比例1∶500），4℃过夜孵育，PBS冲洗3次，加入二抗，室温下静置120 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）显色，苏木素复染，脱水透明后封片，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：以细胞质中出现淡黄色或黄褐色颗粒状或斑块状染色作为阳性，采用半定量法积分法进行结果判定[5]：①染色强度：0分：无染色；1分：淡黄色；2分：棕黄色；3分：棕褐色；②阳性细胞比例：0分：无着色细胞；1分：阳性细胞比例≤10%；2分：10%＜阳性细胞比例＜25%；3分：阳性细胞比例25%～50%；4分：阳性细胞比例≥50%；③将染色强度评分和阳性细胞比例评分之和作为最终结果，阴性：≤2分，阳性：＞2分。所有结果判定均采用盲法由2位病理科主治医师单独完成，出现结果不一致时由病理科主任医师作出最终判定。

1.2.2 细胞培养及分组处理 取人小细胞肺癌H446细胞株，置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在含5%二氧化碳CO2的37℃恒温培养箱中培养[6]。消化后，传代培养，取对数生长期细胞完成实验。对细胞进行转染并分组。①siRNA-Vav3组，转染Vav3干扰序列：正向5'-GGAAGGGTTCAGAACCTTA-3'，反向5'-GAAGATCTCTATGACTGTG-3'；②siRNA-对照序列组，转染对照序列：正向5'-UUCUCCGAACGUGUCA CGUTT-3'，反向5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'；③空白组，不作任何处理。转染后培养48h完成后续实验。

1.2.3 qRT-PCR检测各组细胞中Vav3基因表达 取各组转染后培养48h细胞，加入细胞裂解液，用Trizol总RNA提取试剂盒获得总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA纯度，以A260/A280在1.80～2.30为合格。逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA[7]，以cDNA作为模板进行PCR。引物序列：VAV3正向5'-TGAAGGCAGAGGAAGCACAT-3'，反向5'-GCATAG GAACCACAAGCAAGT-3'；β-Actin 正向 5'-GTCATTC CAAATATGAGATGCGT-3'，反向 5'-GCATTACATAAT TTACACGAAAGCA-3'[7]。PCR反应条件：95℃预变性1min，94℃变性30s，58℃退火30s，74℃延伸30s，连续循环38次。每个样品均设3个平行反应复孔。用2-△△Ct法计算各组细胞中Vav3基因相对表达量。

1.2.4 划痕实验检测各组细胞迁移能力 取各组转染后培养48h细胞，按2×105个/ml接种于6孔板，待细胞融合度达90%以上时，用200μl枪头于垂直于孔板划直线，且宽度相同，将散落细胞用PBS液去除，分别于0和24h时观察细胞迁移情况并拍照，用Image J图像分析软件分析划痕愈合率=（1～24h时划痕面积/0h时划痕面积）×100%。

1.2.5 Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力 ①迁移能力检测：取各组转染后培养48h细胞，胰酶消化后，接种于6孔板，调整细胞密度为2×106个/ml，取200μl加入到Transwell小室上室，将600μl含20%胎牛血清的培养液加入小室下室，培养12h，多聚甲醛固定15min，结晶紫染色15min，将散落细胞用棉签轻轻去除，PBS冲洗后，显微镜观察，随机取5个视野计数穿膜细胞数。②侵袭能力检测：将50μg Matrigel胶平铺于Transwell小室上室，风干后以备检。其余步骤同迁移能力检测[7]。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SCLC和对照组组织中Vav3蛋白表达比较

SCLC组织中Vav3蛋白阳性表达率为81.6%（71/87），对照组为14.0%（8/50），两组比较，差异有统计学意义（χ2=17.739，P=0.000），SCLC组织中Vav3蛋白阳性表达率高于对照组。见图1。

图1 两组组织中Vav3蛋白表达（免疫组化×200或400）

2.2 SCLC组织中Vav3蛋白表达与临床病理特征之间的关系

SCLC组织中Vav3蛋白表达与性别、年龄、肿瘤位置及吸烟无关（P＞0.05），而与临床分期、远处转移和生存状态有关（P=0.024、0.016和0.014）。见表1。

2.3 SCLC组织中Vav3蛋白表达对预后的影响

Vav3蛋白阳性表达组患者平均生存时间23.14个月，总生存率为35.21%；而Vav3蛋白阴性表达组则为44.89个月，总生存率为68.75%。Vav3蛋白阳性表达组与阴性表达组比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=6.280，P=0.012），Vav3蛋白阳性表达组患者平均生存时间低于Vav3蛋白阴性表达组。见图2。

2.4 各组细胞中Vav3基因表达比较

siRNA-Vav3组、siRNA-对照序列组和空白组细胞中Vav3 mRNA相对表达量分别为（1.17±0.23）、（2.19±0.14）和（2.25±0.16），经方差分析，差异有统计学意义（F=68.751，P=0.000），siRNA-Vav3组细胞中Vav3 mRNA相对表达量低于siRNA-对照序列组和空白组，见图3。

表1 SCLC组织中Vav3蛋白表达与临床病理特征之间的关系 例（%）

图2 SCLC组织中Vav3蛋白表达对患者预后的影响

图3 各组细胞中Vav3基因表达

2.5 各组细胞迁移能力比较

划痕实验结果显示，siRNA-Vav3组、siRNA-对照序列组和空白组细胞24 h后划痕愈合率分别为（12.80±1.54）%、（29.19±3.23）% 和（27.74±1.50）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=98.539，P=0.000），siRNA-Vav3组细胞24 h后划痕愈合率低于siRNA-对照序列组和空白组，见图4。Transwell实验结果显示，siRNA-Vav3组、siRNA-对照序列组和空白组迁移细胞数分别为（87.01±7.68）、（108.54±6.47）和（111.13±11.71）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=13.261，P=0.000），siRNA-Vav3组迁移细胞数低于siRNA-对照序列组和空白组，见图5。

图4 划痕实验检测各组细胞愈合能力

2.6 各组细胞侵袭能力比较

Transwell实验结果显示，siRNA-Vav3组、siRNA-对照序列组和空白组侵袭细胞数分别为（97.18±9.11）、（125.52±9.66）和（130.00±9.98）个，经方差分析，差异有统计学意义（F=20.664，P=0.000），siRNA-Vav3组侵袭细胞数低于siRNA-对照序列组和空白组，见图6。

图5 各组细胞迁移能力比较 （结晶紫×200）

图6 各组细胞侵袭能力比较 （结晶紫×200）

3 讨论

SCLC作为肺癌常见类型，近年来发病率不断升高，临床上主要以全身化疗联合放疗、手术作为主要治疗方式，但治疗效果有限[8]。虽然SCLC细胞对化疗敏感，但极易产生多药耐药，出现复发[9]。有研究指出[10]，SCLC细胞高侵袭、转移能力是影响患者治疗效果及预后的主要因素。因此，积极探讨影响SCLC高侵袭、高转移能力的相关机制，对改善患者预后具有重要意义。Vav3是癌基因家族重要成员，可通过促进三磷酸鸟苷（GTP）酶活化而参与信号转导，在基因转录及细胞转化中发挥作用[11]，同时亦可通过影响Rho家族分子间相互作用而对细胞极性、黏附能力等产生影响[12]。现已证明，Vav3在多种恶性肿瘤组织中呈高表达[13]，在调控肿瘤发生、转移、侵袭等过程中发挥重要关键性作用[14]。本研究结果显示，Vav3蛋白在SCLC组织中阳性表达率高于对照组，说明Vav3蛋白在SCLC组织中呈高表达，提示Vav3蛋白可能参与SCLC发生过程。进一步分析与临床病理特征之间的关系，结果显示，SCLC组织中Vav3蛋白表达与临床分期、远处转移和生存状态有关（P＜0.05），广泛期、发生远处转移和死亡患者组织中Vav3蛋白表达量增加，提示Vav3蛋白可能参与SCLC侵袭转移过程，且与患者预后有关。Kaplan-Meier生存分析显示，SCLC组织中Vav3蛋白阳性表达组患者总生存率低于Vav3蛋白阴性表达组，进一步表明SCLC组织中Vav3蛋白表达与患者预后密切相关。

为进一步探讨Vav3在SCLC侵袭转移中的作用，本研究利用siRNA技术特异性沉默H446细胞中Vav3基因，结果显示，siRNA-Vav3组细胞中Vav3 mRNA相对表达量低于siRNA-对照序列组和空白组，说明H446细胞中Vav3基因被成功抑制。研究表明[15]，Vav3及其反向信号分子可通过参与调控机体内多条信号转导，而在肿瘤细胞黏附、侵袭、转移中发挥重要作用。本研究划痕实验和Transwell实验结果均显示，siRNA-Vav3组划痕愈合率和迁移细胞数均低于siRNA-对照序列组和空白组，说明特异性沉默H446细胞中Vav3基因可有效抑制细胞迁移能力，同时，本研究结果显示，siRNA-Vav3组侵袭细胞数低于siRNA-对照序列组和空白组，说明特异性沉默H446细胞中Vav3基因可有效抑制细胞侵袭能力，本结果表明，Vav3基因在小细胞肺癌H446细胞迁移、侵袭过程中发挥重要作用。

综上所述，Vav3蛋白在SCLC组织中呈高表达，且与患者预后密切相关，特异性沉默SCLC细胞中Vav3基因可抑制细胞迁移和侵袭能力，有望为SCLC综合防治提供新的靶点。