IgA肾病大鼠尿维生素D结合蛋白与肾脏纤维化关系的研究*

何国华，容丽萍，姜梦婕，蒋小云

（1.广东省佛山市妇幼保健院 儿科，广东 佛山 528000；2.中山大学附属第一医院 儿科，广东 广州 510089）

IgA肾病是全球最常见的原发性肾小球疾病之一[1]。在成人患者，每10年约有20%的患者进展至终末期肾病（end stage renal disease,ESRD）[2]。IgA肾病进展至ESRD的危险因素包括蛋白尿、高血压、肾功能不全、新月体形成、肾小球系膜细胞重度增生、肾小球硬化、肾小管纤维化等[1]。对IgA肾病小管间质纤维化，目前缺乏早期的、有效的、无创的指标。转化生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）/Smads信号通路是包括肾脏在内的多种组织纤维化的最主要通路之一，在IgA肾病患者肾组织中，TGF-β1表达与肾小管损伤及间质纤维化程度呈正相关[3]。

维生素D结合蛋白（vitamin D binding protein,VDBP）分子量为5.8 kD，是血浆中维生素D及其代谢产物的主要转运蛋白[4]。VDBP在肝脏合成，在肾小球被滤过，在近曲小管由受体介导重吸收[5]。当肾小管受损伤时，VDBP重吸收功能降低，在庆大霉素造成的肾炎大鼠模型中的研究发现，尿VDBP能够作为肾小管间质损伤的一个生物学标记，并且独立于蛋白尿的存在[6]，该发现提示尿VDBP可以作为一个无创性的尿液标志，用于监测小管间质纤维化。

本研究运用改良的牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）+脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）+四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）方法复制实验性IgA肾病大鼠模型[3]，研究尿VDBP在IgA肾病肾小管间质纤维化中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型的复制及分组

健康清洁级5周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠采购自广东省医学实验动物中心，共20只，体重120～140 g，随机分为对照组，模型组，每组10只。其中模型组运用改良的BSA+LPS+CCl4方法复制实验性IgA肾病大鼠模型[3]。具体方案：将免疫原BSA以蒸馏水配成10%浓度，隔天灌胃400 mg/kg，持续8周；皮下注射蓖麻油0.3 ml+CCl40.1 ml，每周1次，持续9周；LPS以生理盐水配成0.025%浓度，于实验第6周尾静脉注射0.05 mg。同时对照组大鼠给予蒸馏水灌胃，生理盐水皮下注射及尾静脉注射。所有大鼠在实验期间均予标准饮食。在实验第10周末收集尿标本后处死大鼠收集血标本、肾组织标本进行下述测量。

1.2 尿蛋白、尿红细胞及尿VDBP的测量

在实验第10周末使用代谢笼留取大鼠24 h尿，进行尿红细胞镜检，并分别记录尿量，测定24 h尿蛋白。通过酶联免疫吸附法（维生素D结合蛋ELISA试剂盒，美国Alpco公司）测定尿VDBP含量。

1.3 血生化检测

在实验第10周末，处死大鼠，予10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，心脏取血，用全自动生化分析仪测定血中生化指标，包括：尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）。

1.4 肾脏病理检查

大鼠处死后取约0.2 cm厚度矢状面切片，置于10%甲醛固定，48 h内行石蜡包埋，用于光镜检查及免疫荧光IgA检查。IgA免疫荧光强度判定，根据目前国内外通用标准，参照5级半定量法分为-～++++5个等级。①-：低倍镜下不能显示、高倍镜下似乎可见；②+：低倍镜下似乎可见，高倍镜下可见；③++：低倍镜下可见，高倍镜下清晰可见；④+++：低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；⑤++++：高倍镜下刺眼。使用Masson三色染色评估肾脏组织纤维化程度[7]，胶原纤维呈蓝色，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行半定量分析，以胶原纤维在肾组织含量的百分比表示肾脏组织的纤维化程度。

1.5 TGF-β1蛋白表达的检测

采用Western blot法检测。将样品组织研成粉末，加入裂解液提取总蛋白，BCA法测定计算蛋白质浓度。取相同质量的蛋白质变性，上样，SDS-PAGE电泳、转膜。封闭液封闭120 min，后置于一抗孵育，反应时间90 min，洗膜，二抗孵育60 min，洗膜，用化学发光置于暗夹内曝光、依次显影、定影。将胶片进行扫描，应用Quantity One图像分析软件对凝胶图像条带进行分析，计算目标条带的净光密度值。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验，相关性分析用Pearson法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏病理结果

对照组大鼠肾小球无明显IgA沉积，荧光强度-～±（见图1A、B），模型组肾小球系膜区均可见团块状或颗粒状绿色IgA荧光，荧光强度++～+++（见图1C、D），提示IgA肾病大鼠模型复制成功。

2.2 血生化检测结果

两组BUN、Scr、TP、ALB水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.3 各组24 h尿蛋白、尿红细胞、尿VDBP的变化

模型组24 h尿蛋白、尿红细胞、24 h尿VDBP高于对照组，差异有统计学意义（均P＜0.05）。见表2。

2.4 各组肾纤维化及TGF-β1蛋白表达水平的变化

在Masson染色病理改变上，对照组肾小球、肾小管及间质组织病理形态无异常，系膜区基质及细胞未见增加，肾小管、肾间质、血管无明显病变，肾组织鲜有蓝色胶原纤维着色区域（见图2A）。模型组Masson染色见系膜区中到重度不同程度细胞及基质增生，部分肾小球基底膜、系膜区见蓝色线条状区域，在肾间质小管处可见斑块条状蓝色区域散在分布，血管胶原纤维也呈蓝色着色（见图2B）。

模型组胶原纤维含量[（13.80±6.18）%]高于对照组 [（1.23±1.07）%]差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

模型组肾组织TGF-β1蛋白表达水平（1.03±0.14），高于对照组（0.61±0.14），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.5 相关性分析

所有大鼠24 h尿VDBP与尿蛋白呈正相关（r=0.859，P=0.000），与肾纤维化呈正相关（r=0.908，P=0.000），与TGF-β1蛋白表达呈正相关（r=0.859，P= 0.009）。见表3和图3。

图1 两组大鼠肾脏病理学改变 （免疫荧光）

表1 两组血生化检测结果 （n =10，±s）

表1 两组血生化检测结果 （n =10，±s）

ALB/（g/L）对照组 8.07±0.76 39.28±4.33 60.53±3.20 25.97±1.83模型组 7.41±1.03 39.46±5.36 59.47±3.18 26.36±1.08 t值 1.625 -0.083 0.743 -0.580 P值 0.122 0.935 0.467 0.570组别 BUN/（μmol/L）Scr/（mmol/L）TP/（g/L）

图2 两组大鼠肾脏染色结果 （Masson×100）

表2 两组尿蛋白、尿红细胞、尿VDBP、胶原纤维、肾组织TGF-β1蛋白表达水平的比较 （n =10，±s）

表2 两组尿蛋白、尿红细胞、尿VDBP、胶原纤维、肾组织TGF-β1蛋白表达水平的比较 （n =10，±s）

组别 尿蛋白/（mg/24 h） 尿RBC/（个/Hp） 尿VDBP/（μg/24 h） 胶原纤维/% TGF-β1对照组 5.40±1.50 4.50±2.64 0.19±0.09 1.23±1.07 0.61±0.14模型组 23.44±2.72 158.20±86.38 0.65±0.27 13.80±6.18 1.03±0.14 t值 -18.360 -5.624 -5.154 -6.330 -6.500 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 尿蛋白、尿VDBP与肾脏纤维化的相关性

表3 尿VDBP分别与尿蛋白、肾纤维化、TGF-β1蛋白表达的相关分析

3 讨论

IgA肾病的临床表现多样，轻重程度不一，从无症状的尿检异常到急性肾衰竭均可出现。IgA肾病病理改变多种多样，但时常有不同程度的肾间质病变，研究发现，小管间质受累程度影响到肾小球病变的转归[8-9]。在IgA肾病患者中，部分肾小球病变严重，但间质病变轻微的患者长期预后较好，而间质损害严重，小球病变轻微的病例长期随访预后不佳，提示肾脏间质纤维化是预测IgA肾病病情预后的重要指标[10]。

VDBP为簇特异性蛋白（group-specific component,Gc）分子量为5.8 kD，在体内有多重作用，包括转运维生素D，调控体内炎症反应以及免疫调节等作用[11]。VDBP在肝脏合成，经过肾小球滤过，在近曲小管重吸收[5]，因此，尿中的VDBP水平很大程度取决于肾小管的重吸收功能。当肾小管间质出现纤维化改变时，可以导致尿VDBP重吸收减少，从而使尿中VDBP升高[6，12]，上述研究为检测尿VDBP水平反应小管间质损伤提供理论依据。

本研究结果显示，IgA肾病模型组尿VDBP高于对照组。既往其他动物模型及肾病患者研究中，亦发现肾损伤时尿VDBP水平升高：在阿霉素大鼠模型中，尿VDBP在肾损伤早期即出现升高，与小管间质纤维化的指标密切相关[6]，并且独立于白蛋白尿[6]。在大鼠尿毒症模型中，发现从尿中丢失VDBP增多[13]。而在糖尿病肾病患者的研究中发现，尿VDBP排出量增加[14]。本研究也发现，模型组尿VDBP定量高于对照组，说明在IgA肾病在肾损伤时会出现尿VDBP定量升高。

TGF-β1/Smad3信号通路在肾小球硬化、肾小管损伤和肾间质纤维化过程起其重要的作用。TGF-β1与具有丝氨酸-苏氨酸活性的细胞的表面受体过特异性结合，并激活该受体，启动免疫应答，作用于相应的靶基因，如纤连蛋白（fibronectin,FN），调节其转录、表达。FN表达水平上调意味着细胞外基质（extra cellular matrix,ECM）积聚，最终会出现肾小球硬化和肾间质纤维化[15]。在IgA肾病患者肾组织中，TGF-β1表达与FN表达呈正相关，并且与肾小管损伤及间质纤维化呈正相关[15]。本研究进一步发现，24 h尿VDBP水平与肾脏纤维化程度以及TGF-β1蛋白的表达呈正相关，提示尿VDBP可以反映肾脏纤维化程度，并随着肾损伤的严重程度而增加。尿VDBP水平与肾小管细胞巨噬细胞浸润程度以及胶原纤维表达呈正相关，并与多种小管损伤因子呈正相关[6]。CKD患者中研究发现，尿VDBP随疾病的严重程度而增加[16-17]。提示尿VDBP可能涉及肾脏纤维化过程中多种系统免疫调控，但尚有待进一步研究证实。

本研究发现，在IgA肾病模型中，24 h尿VDBP与24 h尿蛋白呈正相关。在阿霉素大鼠模型研究中，尿VDBP在肾损伤早期升高，并且独立于白蛋白尿，提示尿VDBP在尿蛋白出现改变之前即可发生改变，反应肾损伤的程度[6]。本实验研究结果显示，模型组大鼠的尿蛋白及尿VDBP水平高于对照组，尿VDBP组间的差异与肾脏纤维化程度及在肾组织纤维化的程度改变一致，提示与尿蛋白相似，尿VDBP能反应肾组织纤维化的程度。在CKD患者的一项研究中发现，尿VDBP在CKD患者中升高，并且与蛋白尿水平呈正相关[18]，其研究结果与本实验研究发现一致。推测其原因，无论是阿霉素肾病大鼠、IgA肾病大鼠、CKD患者，其蛋白尿成分主要为白蛋白，白蛋白分子量为6.85 kD，分子量比VDBP大。白蛋白主要经过肾小球滤过，在肾小球滤过屏障损伤时，尿中白蛋白升高，是尿蛋白的主来源。尿蛋白水平是公认的反应肾小球滤过屏障损伤的指标，而前述研究中提到，尿VDBP是在肾小管被重吸收，尿中VDBP水平反应肾小管损伤及间质纤维化程度的指标。故从反映肾纤维化角度出发，尿VDBP可能是比尿蛋白更敏感、准确的指标。提示尿VDBP可以作为一个无创性的尿液标志，用于早期监测小管间质炎症和纤维化。在不同的肾脏疾病中，尿VDBP水平与尿蛋白水平是否存在相关性该问题，值得进一步探讨。

本研究发现，IgA肾病大鼠尿VDBP升高，尿VDBP与肾纤维化、尿蛋白呈正相关，尿VDBP可作为监测IgA肾病大鼠肾纤维化的一个无创的生物学指标。