T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1在子宫颈癌组织中表达及意义

汪俊，王芳，史亚男

(1.武汉科技大学附属汉阳医院，湖北 武汉 430000；2.中山大学第一附属医院，广东 广州 510000)

子宫颈癌作为常见的妇科恶性肿瘤，发病率高、病死率高，且发病率呈逐年升高，发病年龄年轻化[1]，监测数据显示[2]，发展中国家子宫颈癌高发，每年新发病例约占全球发病例的90%，给发展中国家女性健康带来严重威胁。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)作为一种原癌基因，在不同类型细胞形态转化、细胞迁移、运动、黏附、凋亡等过程中发挥重要作用[3]，有研究指出[4]，Tiam1可通过催化Rho样鸟苷三磷酸酶(GTPase)并激活Rac1信号通路从而参与肿瘤细胞迁移、侵袭、浸润等过程。多项研究表明[5-7]，Tiam1在多种恶性肿瘤侵袭转移过程中发挥重要作用。本研究对子宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(CIN)和正常宫颈组织中Tiam1基因和蛋白表达进行检测，探讨其在子宫颈癌发生及进展中的意义。

1 资料与方法

1.1一般资料留取2010年1月至2012年1月在武汉科技大学附属汉阳医院行手术切除的子宫颈组织183例，其中，子宫良性病变留取正常宫颈组织43例，年龄(40.2±10.7)岁，年龄范围30～65岁；宫颈上皮内瘤变(CIN)组织56例(CIN Ⅰ 23例，CIN Ⅱ～Ⅲ 33例)，年龄(39.4±10.1)岁，年龄范围29～60岁；子宫颈癌组织84例(鳞癌53例，腺癌31例)，年龄(41.3±11.5)岁，年龄范围31～67岁。三组病例年龄差异无统计学意义(P>0.05)，均衡可比。所有研究对象采集标本前均未接受放化疗治疗，留取的新鲜组织标本分为两份，一份立刻置于-80 ℃中保存，一份制备石蜡切片。按国际妇产科联盟(FIGO)2009年分期标准子宫颈癌患者：Ⅰ期28例，Ⅱ期56例；病理分级：G1 15例，G2 38例，G3 31例；发生淋巴结转移25例；术后均获得随访，随访截止时间2016年12月30日。本研究通过本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂和设备总RNA提取试剂盒(Trizol法)购自美国Invitrogen，逆转录和PCR试剂盒均购自日本Takara，Tiam1和内参引物均由上海生工公司设计合成，SP免疫组织化学试剂盒、DAB试剂、PBS均购自北京中杉金桥公司，兔抗人Tiam1多克隆抗体购自美国Santa Cruz，实时荧光定量PCR仪购自美国ABI，光学显微镜购自日本Olympus。

1.3方法

1.3.1利用实时荧光定量PCR技术检测不同组织中Tiam1mRNA表达 取不同子宫颈组织，研磨后，加入细胞裂解液裂解，用总RNA提取试剂盒提取不同组织中总RNA，利用紫外分光光度计对总RNA纯度进行检测，以A260/A280≥1.80作为合格标准。将总RNA逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为，用PCR试剂盒进行扩增。引物序列：Tiam 1引物：上游：5′-CAGGACTCCACGGGGCCTCA-3′，下游：5′-AGTGCTCCTCGCTCTCCGCA-3′；β-actin引物：上游：5′-CGGG-GTCACCCACACTGTGC-3′，下游：5′-GGGCAGCGGA-ACCGCTCATT-3′。PCR反应条件：94 ℃ 30 s，92 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，连续进行36次循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。用2-△△Ct法获得不同组织中Tiam1基因相对表达量。

1.3.2利用免疫组织化学法检测不同组织中Tiam1蛋白表达 石蜡标本经切片、脱蜡、水化后，用3%过氧化氢-甲醇37 ℃孵育30 min对内源性过氧化物酶进行阻断，PBS洗涤3次，加入柠檬酸缓冲液煮沸10 min，冷却后，PBS冲洗3次，室温条件下，滴加10%山羊血清封闭20 min，加入一抗兔抗人Tiam1多克隆抗体(1 ∶500)，4 ℃过夜孵育，PBS冲洗3次，以同型IgG作为阴性对照，加入增强剂，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次，加入HRP标记二抗，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次， DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，于光镜下进行观察。结果判定[8]：所有切片均由两位具有副主任及以上职称的病理科医师独立完成，以细胞质中出现黄色、棕黄色或黄褐色染色视为Tiam1蛋白表达阳性：①染色强度：0分，不染色；1分，染成淡黄色；2分，染成棕黄色；3分，染成棕褐色；②阳性细胞比例：0分，≤5%；1分，>5%～25%；2分,>25%～75%；3分,>75%；③总评分=染色强度评分×阳性细胞比例评分。0分，阴性；1～3分,弱阳性；4～6分,中等阳性；7～9分,强阳性；以弱阳性、中等阳性和强阳性作为判断Tiam1蛋白阳性表达。

2 结果

2.1Tiam1mRNA不同子宫颈病变组织中表达比较PCR结果显示，子宫颈癌组织中Tiam1 mRNA相对表达量均高于CIN组织和正常宫颈组织，且CIN组织高于正常宫颈组织，均差异有统计学意义(P<0.05)，CIN Ⅰ组织中Tiam1 mRNA相对表达量为(1.54±0.19)，显著低于CIN Ⅱ～Ⅲ组织的(1.81±0.23)，差异有统计学意义(t=22.186，P=0.016)，即子宫颈癌组织> CIN Ⅱ～Ⅲ组织> CIN Ⅰ组织>正常宫颈组织，详见表1。

2.2Tiam1蛋白在不同子宫颈病变组织中表达比较子宫颈癌组织中Tiam1蛋白阳性表达率高于CIN组织和正常宫颈组织(P<0.05)，组间两两比较采用χ2检验，CIN组织高于正常宫颈组织，均差异有统计学意义(χ2=11.726，P=0.001)，CIN Ⅰ组织中Tiam1蛋白阳性表达率为26.1%(6/23)，低于 CIN Ⅱ～Ⅲ组织的60.6%(20/33)，差异有统计学意义(χ2=6.493，P=0.011)，即子宫颈癌组织> CIN Ⅱ～Ⅲ组织> CIN Ⅰ组织>正常宫颈组织，详见表2和图1。

表1 Tiam1 mRNA在不同子宫颈病变组织中表达比较

注：与正常宫颈组织相比，aP<0.05；与CIN组织相比，bP<0.05

表2 Tiam1蛋白在不同子宫颈病变组织中表达比较/例(%)

注：与正常宫颈组织相比，aP<0.05；与CIN组织相比，bP<0.05

2.3Tiam1mRNA和蛋白在子宫颈癌组织中表达与临床病理特征之间的关系子宫颈癌组织中Tiam1 mRNA相对表达量和蛋白阳性表达率均与临床分期、病理分级、浸润深度、淋巴结转移有关(P<0.05)，而均与年龄、病理学类型、肿瘤直径无关(P>0.05)，详见表3。

2.4子宫颈癌组织中Tiam1表达与患者预后之间的关系以子宫颈癌组织中Tiam1 mRNA相对表达量P25为界值，将患者分为高表达组(n=63)和低表达组(n=21)，Kaplan-Meier生存分析结果显示，高表达组患者生存时间44.13个月，低表达组患者生存时间61.00个月，Log-Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=6.081，P=0.014)，详见图2；子宫颈癌组织中Tiam1蛋白阴性表达患者生存时间63.76个月，阳性表达患者生存时间34.67个月，Log-Rank检验显示差异有统计学意义(χ2=11.359，P=0.001)，详见图3。以生存时间为因变量，Tiam1表达(阴性=0，阳性=1)和单因素分析有意义的临床病理特征为自变量进行Cox比例风险回归模型分析，结果显示，临床分期、淋巴结转移和Tiam1表达是患者预后的影响因素(P<0.05)，见表4。

表3 Tiam1 mRNA和蛋白在子宫颈癌组织中表达与临床病理特征之间的关系

注：与G1相比，aP<0.05；与G2相比，bP<0.05

表4 影响患者预后的Cox风险回归模型分析

图2 子宫颈癌组织中Tiam1 mRNA相对表达量对生存时间的影响

图3 子宫颈癌组织中Tiam1蛋白表达对生存时间的影响

3 讨论

子宫颈癌细胞具有很强的迁移和侵袭能力，有研究指出[9]，手术时发生盆腔淋巴结转移的子宫颈癌患者术后复发率高达70%～80%。因此，从分子水平探讨影响子宫颈癌细胞迁移、侵袭的相关机制，对该肿瘤早期诊断、提供基因治疗靶位及改善患者预后具有重要意义[10]。Tiam1作为一种重要的促肿瘤转移基因，在调控二磷酸鸟嘌呤核苷酸和三磷酸鸟嘌呤核苷酸转换，以及催化Ras超家族中发挥重要作用[11]，与细胞形态转化、骨架结构重构、运动、迁移、侵袭等过程密切相关[12]。有研究指出[13]，Tiam1蛋白在多种恶性肿瘤组织中呈高表达，且与肿瘤分化、浸润及淋巴结转移等密切相关。本研究显示，子宫颈癌组织中Tiam1基因相对表达量和蛋白阳性表达量均高于 CIN组织和正常宫颈组织，且子宫颈癌组织> CIN Ⅱ～Ⅲ组织> CIN Ⅰ组织>正常宫颈组织，说明Tiam1在子宫颈癌组织中呈高表达。

本研究结果显示，Tiam1 mRNA和蛋白在子宫颈癌组织中相对表达量与临床分期、病理分级、浸润深度、淋巴结转移有关，临床分期越高、病理分级越高、浸润深度越深、发生淋巴结转移，Tiam1 mRNA相对表达量越高，Tiam1蛋白阳性表达率越高，说明子宫颈癌组织中Tiam1表达与子宫颈癌细胞转移、浸润、侵袭有关，张源等[14]亦研究发现，Tiam1蛋白表达水平与胃腺癌分化程度、临床分期、淋巴结转移及浆膜浸润有关。这些结果进一步提示Tiam1在肿瘤转移及侵袭中发挥重要作用，参与了肿瘤进展过程。有研究指出[15]，Tiam1与恶性肿瘤患者预后密切相关，可作为预测患者预后的指标。Li等[16]指出，Tiam1过表达是浆液性卵巢癌患者预后的独立风险因素。本研究Kaplan-Meier生存分析结果显示，高表达组患者生存时间44.13个月，显著低于低表达组患者生存时间，子宫颈癌组织中Tiam1蛋白阳性表达患者生存时间34.67个月，显著低于阴性表达患者，说明Tiam1表达与子宫颈癌患者预后密切相关，子宫颈癌组织中Tiam1高表达预示患者预后不良，可作为预测患者预后的指标。

综上所述，Tiam1基因和蛋白在子宫颈癌组织中呈高表达，可能参与了子宫颈癌发生、转移、侵袭等过程，且与患者预后有关，有望成为患者预后预测的一种潜在分子指标。

(本文图1见插图9-2)