高效液相色谱法同时测定陈皮配方颗粒中3种成分的含量

李文东，梅雪，赵玉玺，魏莹，李红君，幸婷婷，刘福

(1.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充 637000；2.川北医学院药学院药物研究所，四川 南充 637000)

中药配方颗粒，是指以符合炮制规范的单味中药饮片为原料，经现代工艺提取、精制而成的一种粉末或颗粒状制剂[1]。它改变了传统中成药粗、大、黑形式，使传统中药汤剂摆脱了煎煮麻烦、携带不便、口服量大等缺点，使之转变为一种快捷、简单、方便、卫生的剂型，是中药汤剂的改革[2]。陈皮来源于芸香科植物橘CitrusReticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾，燥湿化痰的功效，用于治疗胸脘胀满、食少吐泻、咳嗽痰多等[3]。陈皮配方颗粒是以符合炮制规范的陈皮饮片为原料，经现代工艺提取、浓缩、干燥、制粒而成的纯中药产品，其性味、归经、功效、成分与原中药饮片基本一致，具有服用量小、携带保存方便、卫生安全等特点。目前，对陈皮饮片质量控制报道很多，包括性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别、含量测定等；但未见对陈皮配方颗粒含量测定的相关报道。化学成分是中药产生生物效应的物质基础，陈皮[4-6]中的主要活性成分橙皮苷[7]、川陈皮素[8]和橘皮素。本实验采用HPLC 法同时测定其中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量，为陈皮配方颗粒质量的有效控制提供参考方法和科学依据。

1 仪器与试药

1.1仪器十万分之一电子天平(Mettle AE 240)；Agilent-1260型高效液相色谱仪，包括：四元泵，在线脱气机，紫外检测器等；KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，500 W，40 kHz)。

1.2试药中药配方颗粒陈皮(0.5 g相当于饮片6 g；四川新绿色药业科技发展股份有限公司；批号：1604027、1603026、1609028)；橙皮苷、川陈皮素和橘皮素(自制，1H-NMR和13C-NMR、ESI-MS鉴定，含量采用HPLC峰面积归一化法计算不低于98%)；乙腈(HPLC级，赛默飞世尔科技，批号152833)；水为纯水(Millipore水纯化仪自制)；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备分别精密称取减压干燥至恒重的对照品橙皮苷、川陈皮素和橘皮素适量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得含橙皮苷、川陈皮素和橘皮素232.00、15.56、15.40 mg·L-1的混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备取陈皮配方颗粒约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，超声(500 W，40 kHz)提取1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液作供试品溶液，即得。

2.3色谱条件色谱柱为Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，二元梯度洗脱：0～6 min，15%A→20%A；6～16 min，20%A→34%A；16～20 min，34% A→52%A；20～28 min，52% A；28～30 min，52%A→100%A；30～32 min，100%A→15%A，流速:1.0 mL·min-1，波长切换(0～16 min，在283 nm波长下检测橙皮苷；16～32 min，在330 nm波长下检测川陈皮素和橘皮素)，柱温:30 ℃；进样量10 μL。色谱图见图1。

2.4定量限和检测限因样品中川陈皮素和橘皮素两个成分的含量较低，故对其最低定量限和检测限进行考察，按上述色谱条件用对照品溶液稀释，结果当S/N=10时，川陈皮素和橘皮素的定量限分别为：8.46、10.13 ng；当S/N=3时，检测限分别为2.36、3.04 ng。

2.5线性关系考察分别精密称取对照品适量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得含橙皮苷、川陈皮素和橘皮素120.18、9.883、4.72 mg·L-1的混合对照品溶液。分别进样1、4、8、10、16、20 μL，按上述色谱条件测定，以对照品的量(ng)为横坐标(X)，色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程。其线性范围、标准曲线和相关系数(n=6)结果见表1。

注：A为混合对照品溶液；B为供试品溶液；1为橙皮苷；2为川陈皮素；3为橘皮素

图1 HPLC色谱图

2.6精密度试验精密吸取混合对照品(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素232、15.56、15.4 mg·L-1)溶液10 μL，在上述相同色谱条件下重复进样6次，测定峰面积。橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的峰面积的RSD值分别为2.2%、1.9%、1.7%，结果表明精密度良好。

2.7重复性试验称取陈皮配方颗粒(批号1604027)共5份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量，结果橙皮苷的平均含量为1.182%，RSD为1.03%；川陈皮素的平均含量为0.072%，RSD为1.29%；橘皮素的平均含量为0.013%，RSD为1.61%；表明重复性良好。

2.8稳定性试验取陈皮配方颗粒约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别在0、2、4、6、8、10、12 h注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定峰面积，橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的峰面积的RSD分别为1.2%、1.1%、1.9%，结果表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.9准确度试验精密称取已测含量(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量分别为1.182%、0.071 8%、0.013 1%)陈皮配方颗粒(批号1604027)的样品共6份，每份约0.25 g，分别精密加入混合对照品溶液(橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的浓度分别为2.955、0.179 5、0.032 75 g·L-1)1 mL，按“2.2”项下制备供试品溶液，再按“2.3”项下色谱条件测定，计算样品含量及加样回收率，结果为见表2。

2.10样品含量测定精密称取3批样品各0.5 g，分别按“2.2”项下制备供试品溶液，“2.1”项下色谱条测定，计算含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果/(%,n=3)

3 讨论

3.1检测波长的选择取橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的对照品溶液置UV-1750紫外可见分光光度计下，于200～700 nm 波长范围内进行扫描，结果橙皮苷在283 nm处有最大吸收，川陈皮素和橘皮素综合考虑在330 nm有较大吸收。结合色谱图，将波长设定为0～16 min时283 nm，16～ 32 min时 330 nm。

3.2色谱条件的选择样品中待分离的3个成分极性不同，等度洗脱难以实现同时分离，故采用梯度洗脱的方法。根据参考文献[9-10]，试验考察了多种流动相系统(甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%醋酸水、乙腈-0.1%醋酸水)结果显示，乙腈-1%醋酸水能达到分离度的要求，分离时间合适，最后确定流动相为乙腈(A)-0.1%醋酸水(B)，二元梯度洗脱：0～6 min，15%A→20%A；6～16 min，20%A→34%A；16～20 min，34%A→52%A；20～28 min，52% A；28～30 min，52%A→100%A；30～32 min，100%A→15%A。

3.3提取条件的选择本试验考察了超声提取法和水浴加热回流法不同提取时间(0.5、1、1.5 h)的提取效果，结果表明，超声提取和水浴加热回流提取0.5 h(提取回收率在90%左右，且提取不完全)；两法提取1、1.5 h，提取回收率均在98%。超声提取操作简便，故本实验采用超声提取的方法提取1 h。

3.4含量测定通过对川北医学院附属医院不同批次样品中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素进行含量测定，结果表明，同一厂家不同批次陈皮配方颗粒3个成分的含量基本相同。2015版《中国药典》的规定，陈皮饮片中橙皮苷的含量不得低于3%；现检测出陈皮配方颗粒中橙皮苷的含量为1.2%左右。可以为陈皮配方颗粒质量的有效控制提供参考。

表2 准确度试验结果(n=6)

4 小结

陈皮配方颗粒失去原饮片的形态特征(如，外表面的颜色及油室、内表面颜色，饮片质地等)，同时也损失其显微鉴别的特征(细胞、结晶的形态等)。因此，制定科学有效的质量标准来控制产品质量，成为配方颗粒安全有效的关键所在。本试验采用HPLC法测定陈皮配方颗粒中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量，方法操作简便、准确可靠和重复性好，可快速准确测定陈皮配方颗粒中橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量。