补骨脂-肉豆蔻药对对脾虚泄泻小鼠肠道功能的保护作用

汪庆飞，高家荣,2，邢亚群，孙祥瑞

(1.蚌埠医学院第二附属医院药剂科，安徽 蚌埠 233003；2.安徽中医药大学第一附属医院国家中医药管理局中药制剂三级实验室，安徽 合肥 230031)

泄泻，是指粪便稀薄、排便次数增加，甚至泻出如稀水样而言。泄为大便溏薄而缓者，泻为大便清稀如水直下者。本病在一年四季均可发生，但以夏秋两季多见，与临床常见的慢性腹泻较相似。作为临床常见的症状，病因很多，如现代医学的慢性菌痢、肠易激综合征、胰原性慢性腹泻、溃疡性结肠炎、肠结核、肠道念珠菌病、肠功能紊乱、肠道肿瘤、结肠过敏、糖尿病腹泻、药源性腹泻等。在治疗慢性腹泻方面，中医有较好的疗效，特别是中药复方制剂，靶点多，可总体调节机体肠道功能，临床应用前景广泛。“二神丸”出自宋·许叔微的《普济本事方》，以补骨脂和肉豆蔻组成，具有温肾暖脾，涩肠止泻之功效，是临床治疗脾虚泄泻的基础方。补骨脂性味：辛、苦、温。归经：入肾、脾经。功能：温肾助阳、纳气止泻。主治：肾虚，冷泻，遗尿，滑精，小便频数，阳痿，腰膝冷痛，虚寒喘嗽。豆蔻性味：辛、温。归经：入脾、胃、大肠经。功能：温中下气，涩肠止泻。主治：虚寒气滞，虚泻冷痢，脘腹冷痛，呕吐，以及肠滑不固，积食不化等症。

本研究旨在探讨补骨脂-肉豆蔻药对对脾虚泄泻肠道的保护作用，利用现代药学的研究方法，即以文献为基础进行实验研究，采用HE染色法、生化法等多种方法，从小鼠的一般状态、胃肠激素等多方面进一步证实补骨脂-肉豆蔻药对对脾虚泄泻的作用，以便选取更安全、有效、严谨的药物剂量、配伍，为临床治疗提供实验参考依据。

1 材料与方法

1.1药物补骨脂：安徽普仁中药饮片有限公司，批号：20141212；肉豆蔻：安徽普仁中药饮片有限公司，批号：20140625；参苓白术散：山西华康药业股份有限公司，批号：20150905；生大黄：产地甘肃，批号：150401；补骨脂-肉豆蔻药对的制备：取补骨脂-肉豆蔻(2 ∶1)药材，加60%乙醇，8倍用量，每次提取1 h，提取2次，合并药液，浓缩，配制成1.05、0.7、0.35 g·mL-1药液备用。本研究起止时间为2015年12月17日至2016年1月11日，符合一般实验动物伦理学要求。

1.2动物昆明小鼠，SPF级，安徽医科大学(合肥)动物实验中心供给，准字号：SCXK(皖)2011-002。室温18～22 ℃，湿度40%～60%，自由饮水饮食。

1.3主要仪器与试剂4%多聚甲醛，批号20121113，购自北京索莱宝科技有限公司。PBS缓冲液，批号：20110807144，购自谷歌生物公司。无水乙醇，批号20110301，购自国药控股化学试剂有限公司。RM2016病理切片机，购自上海徕卡仪器有限公司。JB-P5包埋机购自武汉俊杰电子有限公司。

1.4方法

1.4.1模型复制 昆明种小鼠，雌雄各半，适应性饲养1周。将小鼠按随机区组法随机分正常组、模型组、补骨脂肉豆蔻药对组(21.06、14.04、7.02 g·kg-1)组、参苓白术散组(2.34 g·kg-1)，每组10只。苦寒泻下法，除正常组按规定每天用蒸馏水灌胃外，其余五组均用100%生大黄水煎剂(含原生药1 g·mL-1)0.2 g/10 g，每日1次，连续8 d，造成脾虚泄泻模型。观察小鼠腹泻或脱肛后，治疗组给予补骨脂肉豆蔻药对(21.06 g·kg-1)、补骨脂肉豆蔻药对(14.04 g·kg-1)、补骨脂肉豆蔻药对(7.02 g·kg-1)和参苓白术散(2.34 g·kg-1)灌胃，正常组和模型组给予等量溶媒，每天1次，连续给药2周。

1.4.2一般形态学观察 观察各组小白鼠的一般体征，如体质量、毛色、神志、活动频率等情况。

1.4.3肠推进试验方法 末次给药后，每只给予30%印度墨汁0.2 mL灌胃，20 min后，处死小鼠，剖腹，取出小肠(十二指肠始端到回盲部)，平放于桌面的白纸上，记录墨汁在肠道中前行的距离以及小肠总长度，用墨水在肠道中前行距离与小肠总长度的比值，作为小肠推进百分率来评价。

推进率(%)=碳素墨水在小肠内推进距离(cm)/小肠全长(cm)×100%。

1.4.4结肠病理组织学观察 取相对固定部位的结肠组织，置于4%多聚甲醛液中保存固定，2 d后依次进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE 染色、再次脱水、再次透明、封片，光镜观察，摄片保存，最后进行组织形态学分析。

1.4.5淀粉酶含量测定 末次给药后，眼球取血，离心制备血清，按照淀粉酶测定试剂盒说明书要求，应用比色测定法测定血清淀粉酶含量。

1.4.6D-木糖的含量测定 由于尿液收集难度较大，常采用测定血清D-木糖。用百分浓度3% D-木糖溶液给灌胃，按说明书要求剂量灌服3% D-木糖溶液，大约60 min后眼球取血，离心制备血清，参照D-木糖试剂盒说明书，采用比色法检测各组血清D-木糖含量。

2 结果

2.1一般情况造模前，各组的体质量差异无统计学意义；造模7 d后模型组相继出现饮水、食欲下降，便溏，毛色不整，体质量减轻，倦怠，嗜卧等症状。给药前，与正常组相比，其余各组体质量明显减小(P<0.01)；给药2周后，与模型组相比，补骨脂-肉豆蔻药对(21.06 、14.04 g·kg-1)体质量增加差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2补骨脂-肉豆蔻药对对脾虚泄泻模型肠推进率影响与正常组相比，模型组墨汁推进率显著增高(P<0.01)，提示脾虚泄泻结肠运动增强；与模型组相比，给药2周后，补骨脂-肉豆蔻药对(21.06 g·kg-1)能明显降低墨汁推进率(P<0.05)，提示其能降低脾虚泄泻的结肠运动，参苓白术散组有类似的疗效，见表2。

表1 补骨脂-肉豆蔻药对对小鼠体质量的影响

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

2.3结肠病理组织学观察HE染色结果显示：与正常组比较，模型组出现结肠膜萎缩变薄，腺体细胞增生，层次增多排列紊乱，并伴有大量炎细胞润。与模型组相比，补骨脂-肉豆蔻药对则明显减轻了上述症状，炎细胞浸润减少，腺体排列规则，结构清楚；提示补骨脂-肉豆蔻药对对肠黏膜修复及炎性病理改善有一定的效果(见图1)。

2.4酶活性检测(生化法)D-木糖、淀粉酶的含量与正常组相比，模型组血清中D-木糖和淀粉酶的含量显著降低(P<0.01)；与模型组相比，给药2周后，补骨脂-肉豆蔻药对组(14.04 g·kg-1、21.06 g·kg-1)能不同程度的升高血清中D-木糖和淀粉酶的含量(P<0.05 或P<0.01)，结果见表3。

3 讨论

泄泻是医院门诊常见的一种疾病，泄是指便稀薄，间断发作，来势缓者；泻指大便直下，如水倾注，来势急者。二者统称为泄泻。最早《黄帝内经》[1]称为泄，有“洞泄”“濡泄”之说。汉唐以后称为“下利”，直到宋代才称为“泄泻”。泄泻的病因较为复杂，如寒泻、热泻、虚泻、湿泻、食泻等。其中虚泻又包括脾虚泻、肾虚泻。而脾虚泄泻是由于脾虚湿盛，困厄脾胃，致运化异常，又称濡泄。临床常见症状[2]大便稀薄，时停时泻，完谷不化，略进油腻食物，则便次增多，腹胀不适，饮食减少，面黄，体无力，舌淡苔白，脉弱。虽然该证一般认为是大便溏薄，但有时临床常见症状是大便先溏后干，或者是先干后溏，或者是干溏结合，不可认为都是溏浠状[3]。该证为脾不健运时称之为脾阳虚。脾的功能调节需脾阳和脾阴共同完成，缺一不可。脾主运化，多指脾阳的作用，但须有脾阴的协同，二者相辅相成，缺一不可。同时，脾胃互为表里，脾升清与胃降浊的平衡调节是维持脏腑气机畅通，水谷精微正常吸收、分布、代谢的前提条件。脾虚气陷，清阳当升不升，湿浊不化，则清浊杂混而下，遂成泄泻之症状。由此可知脾虚湿盛是导致该证的首要病因[4]。自20世纪80年代以来，有关脾虚泄泻证实质研究主要从脾主运化展开。普遍研究认为，脾虚泄泻主要临床表现为淀粉酶活性降低，D-木糖排泄率下降，胃肠功能紊乱，胃肠道激素异常等[5]。杨维益等[6]发现血清中的淀粉酶及胰脂肪酶活性也有不同程度的降低。脾虚还表现为免疫功能降低，副交感神经功能亢进，肠道二群感染等[7]。许多传统中草药在治疗脾虚泄泻证中发挥着极其重要的作用，如中药复方制剂“益糖康”可以减少脾虚泄泻小鼠血清炎症因子的表达、“四君子汤”能够减轻大鼠的脾虚泄泻症状以及中药“神曲”有调整脾虚泄泻小鼠肠道菌群及保护肠黏膜的作用等。

表2 给药治疗2周后对肠推进试验的影响

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

表3 补骨脂-肉豆蔻药对对脾虚泄泻血清中D-木糖和淀粉酶含量的影响

注：与正常组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01，cP<0.05

“二神丸”出自宋·许叔微的《普济本事方》[8]，由补骨脂和肉豆蔻组成。补骨脂为豆科植物，性味辛、温、微苦，归肾脾经，具有温肾助阳、纳气止泻之疗效。历代中医常用于治肾虚，冷泻、疮疡、遗尿、滑精、阳痿、水肿、尿频，脾胃虚弱，腰膝酸痛，虚寒喘嗽。补骨脂中含有很多活性组分[9-11]，主要有香豆素，如补骨脂素和异补骨脂素)，拟雌内酯类(如补骨脂定)，黄酮类，酚萜类(如补骨脂酚)化合物等。临床应用：用于盗汗、冷痢，如慢性结肠炎、肠结核等;用于健胃，对有脾胃虚寒、鼓肠、腹胀、肠鸣腹痛者较为适宜。近些年来，大量的药理学研究还发现，补骨脂还具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗抑郁、治疗骨质疏松、治疗白癜风、治疗银屑病、治疗血管性痴呆、性激素样作用、增强免疫功能等多重作用。

肉豆蔻是肉豆蔻科肉豆蔻属植物肉豆蔻的干燥成熟种仁[12-14]。肉豆蔻性味：辛、温。归经：入脾、胃、大肠经。功能：温中下气，涩肠止泻[15]，主治：长尾虚寒气滞，虚泻冷痢，脘腹冷痛，呕吐，以及肠滑不固，积食不化等症。临床应用：用于盗汗、冷痢，如慢性结肠炎、肠结核等;用于健胃，对有脾胃虚寒、食欲不振、腹痛、腹胀、肠鸣音亢进者较适宜。补骨脂-肉豆蔻醇提物是治疗脾虚泄泻的传统古方， 但是文献资料研究多为对该方组成药物补骨脂、肉豆蔻的单味药物研究，对于复方的研究很少，且极少数研究其组方剂量对药效的产生的影响，并且复方对于治疗脾虚的作用研究及其机制也尚不明确。因此本研究重点探讨了“补骨脂-肉豆蔻醇提物”复方在大黄诱导小鼠脾虚泄泻模型中发挥的作用及其潜在的机制。

本研究表明补骨脂-肉豆蔻醇提物有如下功能：补骨脂-肉豆蔻醇提物有明显的止泻作用，并且能明显提高脾虚泄泻小鼠体重、降低小鼠肠推进率、对腹泻小鼠的肠黏膜修复及炎性病理改善有一定的效果。

综上所述，从胃肠功能角度来研究补骨脂-肉豆蔻醇提物对脾虚泄泻小鼠的作用机理得到证实，提示补骨脂-肉豆蔻醇提物有保护肠黏膜的作用，且通过对其机制的研究，为今后治疗脾虚泄泻提供了潜在的靶点。

(本文图1见插图9-1)