圈养华南虎粪便细菌总DNA提取方法比较

李龙显 ，陈茂金 ，林敏 ，曹玲霞 ，李雅婷 ，邓贤才 ，邬向东

（1.江西农业大学动科院，江西 南昌 330045；2.江西农业大学兽医院）

华南虎是中国的十大濒危动物之一、国家一级保护动物，红色物种名录极度濒危，在野外已灭绝。目前南昌市动物园饲养着20多只华南虎，为了解圈养华南虎肠道细菌与腹泻的相关性，本研究拟对南昌市动物园圈养的华南虎新鲜粪便进行细菌总DNA提取，然后进行微生物多样性分析，以了解正常与腹泻时粪便中细菌群落的变化规律，为防治华南虎腹泻提供一定的科学依据。

高质量的总DNA的提取是通过高通量测序研究肠道微生物的前提，直接关系到后续实验的可行性和准确性。粪便组成复杂，不同食性动物粪便组成又有所区别，从而使得提取粪便微生物总DNA的方法通用性较差。因此，找到一种适合本实验研究的粪便样品微生物总DNA提取方法尤为重要。本文选取了常用的6种提取方法和2种提取策略组合成新的方法，分别提取肉食性动物粪便总DNA，对比其提取效果，找出最适合的提取方法，为进一步研究圈养华南虎肠道微生物提供适合的研究方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及配制。100bp DNA Lodder、Taq×2 PCR mix、λDNA/HindⅢ （北京全式金公司）；Tris 平衡酚、CTAB、溶菌酶、蛋白酶、RNase A、粪便基因组DNA提取试剂盒（北京索来宝生物科技公司）；琼脂糖（西班牙BIOWEST）；氯仿、异戊醇（国产分析纯）。

裂 解 液 Ⅰ ：1.17%NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)、1%SDS、1.86%EDTA Na2、1%Triton X-100，灭菌存放。

裂 解 液 Ⅱ ：0.25 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、0.01 mol/L EDTA（pH8.0）、0.05%SDS、0.029%NaCl，灭菌存放。

CTAB 溶液：0.4%CTAB、0.1 mol/L Tris-HCl、0.01 mol/L EDTANa2、1.4 mol/L NaCl 、1%PVP K-30，调pH至7备用。

酚、氯仿、异戊醇配比：取50%体积酚、48%体积的氯仿、2%体积的异戊醇混合，避光保存。

1.1.2 主要设备。5415R冷冻高速台式离心机（美国Eppendorf公司）；960型梯度PCR仪 （杭州晶格公司）；JY300C型电泳仪、JY02S型紫外分析仪 （上海君意东方公司）；超净工作台（苏州净化设备公司）；SPX-150B-Z型生化培养箱（上海博迅公司）。

1.1.3 相关引物。本研究采用细菌16S rDNA全长通用引物，预计扩增DNA片段长度大约为1500bp，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

引物名称 引物序列（5'→3'） 16SrDNA上的位置27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 27-46 1429R GGTTACCTTGTTACGACTT 1410-1429

1.2 方法

1.2.1 样品采集。早晨8～9点气温较低时，用无菌冻存管从南昌动物园采集新鲜的华南虎粪便。用无菌烧杯称取粪便2.4 g，加入12 mL PBS溶液震荡搅拌均匀，分装12支1.5mL离心管中。

1.2.2 粪便微生物总DNA提取

取6支粪便样品直接提取DNA；另取6支粪便样品经预处理后再提取DNA，预处理方法见1.2.2.1。

1.2.2.1 样品预处理。将粪便样品震荡混匀，4℃800 rpm离心5 min取上清；取沉淀加1 mL PBS重悬，相同条件重复离心1次；弃上清，4℃12 000 rpm离心5 min取沉淀，沉淀用PBS洗涤3次，4℃ 12 000 rpm离心5 min，留沉淀备用。

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1.2.2.2 总DNA提取方法。经文献查询，共选择了6种方法，分别是：

方法1（酶化学法Ⅰ）：分别取未处理样品和预处理样品各 1份，加入 200 μL TE，20 μL溶菌酶(100 mg/mL)，37℃处理 40 min，加入 500 μL 裂解液Ⅰ，10 μL 蛋白酶 K (20 mg/m L)，55℃水浴过夜；加入 2 μL RNase A，37℃消化 30 min，4℃ 12 000 rpm离心10 min；取上清置1.5mL的离心管中，用苯酚、氯仿各抽取1次，取上清至离心管；加入50 μL 3 mol/L醋酸钠和1000μL预冷无水酒精，-20℃静置沉淀5h；4℃ 12 000rpm离心10 min，取沉淀加入500μL 70%的乙醇洗涤1次；去上清，干燥15 min，溶于 50 μL ddH2O 中，-20℃保存备用。

方法2（CTAB法）：分别取未处理样品和预处理样品各1份，分别加入CTAB溶液500 μL和β-巯基乙醇2 μL，60℃水浴15min；取上清置1.5 mL离心管中；用酚和氯仿抽取2次；加1 000μL冰预的无水酒精沉淀20min；12 000rpm离心10 min，弃上清；加入预冷的500μL 70%酒精洗涤1次，沉淀于室温晾干；加50 μL ddH2O溶解；并加入终浓度为 20μg/mL的 RNA 酶 A，37℃处理 30 min，-20℃保存备用。

方法3（SDS碱裂解法）：分别取未处理样品和预处理样品各1份，加入600 μL碱性裂解液Ⅱ，剧烈震荡；放入55℃水浴60 min；室温分别加入200 μL 3mol/L醋酸钠，震荡 20s，充分混匀 4℃ 12 000 rpm离心3 min；取上清加入等体积的苯酚、氯仿抽取2次；取上清加入600 μL异丙醇沉淀DNA，4℃12 000 rpm 离心 5 min；弃上清，加入 600 μL 70%乙醇溶液洗涤1次；弃上清，干燥15 min，加入50 μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。

方法4（试剂盒法）：参照试剂盒说明书，分别取未处理样品和预处理样品各1份分别提取总DNA。

方法5（酶化学法Ⅱ）：分别取未处理样品和预处理样品各1份，分别加入100 mg/mL溶菌酶20 μL，37℃温浴 45 min； 再加入 50μL 10%SDS 和15μL 10 mg/mL蛋白酶K，55℃水浴1h； 用酚∶氯仿∶异戊醇抽取1次；用氯仿∶异戊醇抽取一次，取上清加入50μL醋酸钠和1 000 μL-20℃预冷无水酒精混匀，-20℃沉淀 5 h；4℃下 12 000 rpm离心 10 min，取沉淀加入500μL 70%的酒精洗涤1次；去上清液，沉淀干燥 15 min，溶于 50 μLddH2O，并加入终浓度为 20 μg/mL的 RNA 酶 A，37℃放置 30 mi，-20℃保存备用。

以上每个样品处理均重复3次，下同。

1.2.3 目测总DNA溶液颜色及洁净度。肉眼观察6种方法提取粪便样品的总DNA颜色及洁净度，初步判断总DNA质量。

1.2.4 总DNA琼脂糖凝胶电泳分析。取5μL提取的总DNA溶液， 再加入 1 μL 6×DNA Loading buffer上样缓冲液混匀；并使用λDNA/HindⅢ作为maker，1μL ddH2O做模板的扩增产物作为阴性对照，1%琼脂糖电泳35 min，电泳完毕后，将胶放入紫外分析仪内观察并拍照分析结果。

1.2.5 总DNA的得率和纯度测定分析。加2 μL提取的粪便微生物总DNA样品与Nanodrop 2 000微量紫外分光光度计上测定DNA浓度和OD260/OD280值。

1.2.6 总DNA PCR扩增分析。用6种方法分别提取粪便样品总DNA作为模板，采用16SrDNA通用引物27F/1429R对整个16SrDNA基因进行PCR扩增，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。设立以ddH2O为扩增模板的阴性对照。

PCR扩增体系为：

2xPCR Mix 12.5 μL 27F 1.0 μL 1429R 1.0 μL DNA 1.0 μL ddH2O 9.5 μL Total 25.0 μL

反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性 40s，55℃退火50s，72℃延伸50 s，进行33个循环后；最后72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物，并使用100bp DNA Ladder作为 Maker，1 μL ddH2O 做模板的扩增产物作为阴性对照，1%琼脂糖凝胶电泳35 min，取凝胶于紫外分析仪内观察结果并拍照。

2 结果

2.1 目测总DNA溶液颜色和洁净度结果

6种方法分别提取2组粪便样品，每种方法均重复3次。结果总DNA溶液颜色和洁净度如下图1所示。可见经预处理过和未经预处理物粪便样品提取的总DNA溶液都成透明无色状态，6种方法都能除去粪便内的色素等物质。

图1 6种方法提取2组粪便样品总DNA图a～f分别为方法1、方法2、方法3、方法4、方法5、方法6；每幅图从左到右1～3为预处理后提取DNA；4～6为直接提取DNA

2.2 粪便总DNA琼脂糖电泳检测结果

6种不同方法提取2组不同组粪便的总DNA，每个样品重复处理3次，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外分析仪下观察，结果如图2。

如图可见，J1、Z1都有明显的特异性条带，条带大小约为23 kb，说明方法1提取效果较好；J2、Z2没有明显特异性条带且降解较为严重，说明方法2提取效果较差；J3没有明显的特异性条带，Z3有明显特异性条带，说明方法3中，直接法比预处理法更理想。J4、Z4没有特异性条带，说明方法4提取的不理想；J5、Z5都有特异性条带，而且亮度较大，但都伴随有较严重的拖带和降解，这说明方法5提取的DNA浓度较高，但有一定的碎片化；J6、Z6没有明显条带，但降解严重，这可是是方法6煮沸过程中太过于激烈，导致大量DNA断裂。综上我们可知对于华南虎粪便DNA提取以方法1效果最好，方法5其次。

2.3 细菌16S rDNA全长基因扩增分析

用细菌16S rDNA全长通用引物27F/1429R对6种方法提取4组粪便细菌总DNA PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。

图3 6种方法提取2组粪便总DNA 27F/1429R扩增产物电泳图M：100bp DNA Ladder；CK：阴性对照；J1-J6 为 6 种方法对预处理后样品总DNA PCR扩增产物；Z1～Z6为6种方法对未处理样品直接提取DNA进行PCR扩增产物。

方法1、2、4、5都能扩增出特异性条带，但方法1、2提取预处理粪便组的总DNA扩增条带亮度比未处理粪便组总DNA扩增条带高。方法3未处理粪便组重复性差，预处理粪便组有明显特异性条带。方法4、5不受样品预提处理影响，都能扩增出较亮的条带。方法6不论是预处理或不做预处理，提取重复性均不理想。

3 小结与讨论

3.1 样品采集和保存

随着人类活动范围越来越大，对野生动物和植物大量猎杀和采伐，导致野生动物数量越来越稀少。这使得野生动物样本采集变尤为困难。特别是研究其肠道微生物群落结构组成时，采集野生动物肠道样本将损害动物健康。在此种情况下，无损伤性取样方法被学者提出，如采集粪便、血液、毛发作为研究样本。此后该方法多被广泛运用野生动物研究。有研究表明，粪便样品提取的总DNA质量受采集样品环境温度和样本保存方法的影响。环境温度较低时采集样品提取的总DNA质量高于环境较温时采集的样本提取的总DNA质量，而直接冷冻方法保存粪便样品提取总DNA质量高于其他方法保存样品。

本实验采用非损伤性的研究方法，在早上气温较低时到虎笼中采集样品作为研究样本，并迅速放入液氮保存备用。

3.2 粪便样品总DNA提取质量比较

有研究表明，粪便样品提取的总DNA质量受动物食性和提取方法的影响，并且在提取前适当的预处理能减少提取的总DNA中的PCR抑制物存在。因此一种合适的粪便总DNA提取方法就显得尤为重要。

本实验选取了6种常用的粪便DNA提取方法，采用适当预处理和不进行预处理的两组样品。比较6种方法和2种提取策略组合方法中对华南虎最优组合方法。

研究结果显示方法1直接提取粪便效果最好，提取的总DNA纯度高，片段完整度高和生物多样性好。对微生物16S rDNA扩增效果来看，方法1、2经预处理样品扩增效果和方法4、5的PCR扩增效果是最好的，方法1、2未处理粪便样品效果次之，其他方法不太理想。根据提取效果，我们将采用方法1直接提取总DNA，扩增16SrDNA进行一步研究。