1例保育仔猪链球菌的分离鉴定及药敏试验

李志勇，刘胜春，熊云云，熊莉娟

（1.进贤县畜牧兽医局，江西 南昌 331500；2.江西省职业病防治研究院）

猪链球菌病是由猪链球菌 (Streptococcus suis，SS)引起的一种人畜共患急性、热性传染病。急性主要表现为败血症和脑膜炎，发病率和死亡率均较高，慢性主要表现为关节炎、心内膜炎等，其死亡率相对较低［1～2］。 该病分布较为广泛，是危害养猪业的主要细菌性疾病之一，造成严重的经济损失［3～4］。 根据不同的群特异性抗原，兰氏(Lancefield)分类法将链球菌分为20个血清群；按照荚膜多糖的差异，猪链球菌可分为35个血清型 (1型-34型和1/2型)，可引起猪和人发病的血清型包括2、1、9、7和8等，临床上以猪 2 型链球菌为主［5～6］。

2017年12月，江西省南昌市某规模化猪场的保育仔猪出现急性死亡现象，临床症状主要为体温升高，倒地四肢划水等神经症状，死亡率约10%。本文通过对该场送检病猪病料进行细菌分离鉴定，最终确诊由猪链球菌感染引起。根据药敏试验结果，选择高度敏感药物阿莫西林进行治疗，取得较好防治的效果。

1 材料与方法

1.1 病料来源

来源于江西省南昌市某规模化猪场送检1头发病保育仔猪肺脏、肝脏、脑等组织。

1.2 主要试剂

含10%小牛血清的TSA平板和TSB液体培养基均为自行配制；药敏纸片和细菌生化鉴定管购于杭州天和微生物试剂有限公司。PCR反应试剂购自北京全式金生物技术有限公司，胶回收试剂盒、DNA marker（D2000）购自天根生化（北京）有限公司。

1.3 细菌的分离纯化

无菌操作，对送检病猪肺脏、肝脏和脑分别进行细菌分离，划线接种于含10%小牛血清的TSA平板，37℃烛缸培养24h；挑取均匀一致的单个菌落进行一轮纯培养，观察菌落形态，革兰氏染色镜检。

1.4 生化鉴定

取纯培养的细菌菌液，分别接种到生化鉴定管中，37℃烛缸培养24 h，观察并记录结果，参照生化鉴定管说明书确定结果。

1.5 PCR

根据猪链球菌16S rRNA基因序列设计1对检测引物。引物序列：上游引物F∶5'-TGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')； 下游引物 R：5'-CTA CCA GGG TAT CTA ATC CT-3'，预期片段大小为1500bp，引物由金斯瑞生物科技公司合成。

将纯培养的单个细菌菌落接种到5mL含10%小牛血清的TSB液体培养基中，37℃，220 r/min振荡培养过夜，取适量菌液，3000 r/min离心5 min，弃上清，用200 μL TE缓冲液重悬菌体，煮沸10 min，离心，以上清作为待测DNA模板。

PCR 反应体系 （50 μL） ∶10× Buffer 5 μL，dNPTs 4 μL，Taq 酶 0.5μL，DNA 1μL，上、下游引物各 0.5μL，ddH2O 38.5 μL。PCR 反应条件∶94 ℃预变性5min，32个循环 （94℃变性30 s，54℃ 退火 30 s，72℃ 延伸1min）；最后72℃ 延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。PCR产物经胶回收后，送金斯瑞生物科技公司测序。

1.6 药敏试验

挑取分离纯化的单个菌落接种于5mL的含10%小牛血清的TSB液体培养基中，37℃，220r/min振荡培养过夜，取200μL培养菌液均匀涂布于含10%小牛血清的TSA平板，无菌操作，将药敏纸片平贴于培养基表明，37℃培养24 h后测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 剖检病理变化

剖检1头发病保育仔猪，发病猪呈四肢划水等神经症状（图1），心外膜表面有点状或块状出血，胸腔和心包积液，肝脏未见明显病变，脾脏边缘有梗死。

图1 发病保育仔猪

图2 分离菌株培养形态

图3 分离菌株1革兰氏染色

2.2 细菌培养特性及形态特征

在含10%小牛血清的TSA平板上37℃烛缸培养24 h，可见从脑中分离出一株小型圆形隆起，透明，边缘整齐，表面光滑、稍粘稠的灰白色菌落（如图2）。革兰氏染色为阳性球菌，成双球或短链状排列（图 3）。

2.3 PCR测序结果

对分离菌株提取DNA进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，能扩增到约1500bp的特异性条带，与预期大小一致（图4）。将测序序列于NCBI进行BLAST分析，结果表明，该产物为猪链球菌16S rRNA序列。

图4 分离菌株16S RNA扩增电泳图M：D2000；1：分离菌株

2.4 细菌生化特性鉴定结果

生化试验结果表明，分离菌株能分解蔗糖、果糖、葡萄糖、乳糖，不能分解山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖和麦芽糖，尿素反应为阴性，明胶液化为阴性（见表1）。基本符合链球菌的生化培养特征 （陆承平，2008）［7］。

表1 生化鉴定结果

2.5 药敏试验结果

药敏试验结果表明，分离链球菌菌株对阿莫西林、头孢噻肟、头孢唑啉等高度敏感，对哌拉西林、氨苄西林、强力霉素、恩诺沙星等为中度敏感，对庆大霉素、链霉素、复方新诺明等不敏感（如表2）。

表2 药敏试验结果

3 讨论

综合该规模化猪场保育猪的流行病学、病理剖检，并最终通过细菌生化鉴定和PCR鉴定，确诊造成该场仔猪急性死亡的原因为猪链球菌引起。

敏试验结果表明，分离链球菌菌株对阿莫西林、头孢噻肟、头孢唑啉等高度敏感，对哌拉西林、氨苄西林、强力霉素、恩诺沙星等为中度敏感，对庆大霉素、链霉素、复方新诺明等不敏感，与国内相关文献报道基本一致［3］。通过选择高度敏感药物阿莫西林进行治疗，取得明显效果，后续未出现新的病例。该场在前期使用过氟苯尼考和磺胺类药物进行防控，但效果不理想。因此，在临床治疗过程中不要盲目用药，最好先进行药敏试验，再选择敏感药物进行使用，一方面防止延误治疗，另一方面防止耐药性的产生。

随着养猪业规模化、集约化的发展，加上猪圆环病毒病、猪蓝耳病等免疫抑制性疾病的发生，使得猪链球菌病成为猪场重要的细菌性疾病之一，在部分猪场呈现散发流行，给养猪业带来较为严重的经济损失，值得引起重视。临床上该病的防制应注重以预防为主的方针，加强饲养管理，清洁猪舍环境卫生，定期消毒，加强通风，坚持自繁自养和全进全出的原则等；此外，还应做好其它病毒性疫苗的免疫。