刺囊酸对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响

马大昌 陈 诚 武 君 王红磊 吴多明

(兰州大学第一医院乳腺病科，甘肃 兰州 730000)

世界卫生组织发表的《全球癌症报告2014》中显示，全球新发女性乳腺癌患者多达100多万，占女性恶性肿瘤的发病的23%，严重危害女性健康〔1〕。目前，治疗乳腺癌的手段主要包括手术治疗、化疗和放疗，但效果不佳，患者预后较差〔2〕。近年来，从天然产物中寻找毒副作用小、活性强的抗乳腺癌药物成为研究的热点。刺囊酸是从皂荚中提取的三萜酸，已有研究报道刺囊酸对肝癌〔3〕、白血病〔4〕、卵巢癌和子宫内膜癌〔5〕具有显著的抗癌活性，但其对乳腺癌的影响尚未见报道。本研究观察不同浓度刺囊酸对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1细胞和试剂 人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国ATCC细胞库。培养基和胎牛血清购自美国BI 公司。5-乙炔基-2′-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)细胞增殖检测试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑(MTS)购自美国Promega公司。流式细胞检测试剂盒购自美国BD公司。蛋白提取试剂盒和聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白浓度测定试剂购自上海碧云天生物技术公司。Bax一抗、Bcl-2一抗、GAPDH一抗和羊抗鼠二抗购自美国Abcam公司。

1.2细胞培养 人乳腺癌细胞株MCF-7用含10%胎牛血清RPMI1640，37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。

1.3MTS检测细胞活力 取对数生长期的细胞接种于96孔板中(1×105个/ml)，经不同浓度刺囊酸处理24、48、72 h后，吸弃培养基，加入用培养基配置的MTS工作液(MTS∶培养基=1∶5)，培养板放置于培养箱中继续孵育1 h，取出培养板与490 nm检测吸光度OD值，抑制率=〔1-(实验组吸光度值-空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值-空白对照组吸光度值)×100%〕。

1.4EdU检测细胞增殖能力 细胞经不同浓度刺囊酸处理24 h后，加入EdU渗入工作液，培养箱中继续培养3 h，取出培养板，4%多聚甲醛固定30 min，甘氨酸中和多余多聚甲醛后，加入0.5% TritonX-100室温孵育10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后，加入染色液37℃孵育30 min，PBS洗去多余染色液，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核3 min，于荧光显微镜下拍照，蓝色为细胞核，绿色为EdU阳性细胞，即新增殖的细胞，随机选取5个视野求平均值，EdU阳性率=(EdU阳性细胞数/DAPI染色总细胞数)×100%。实验重复 3 次。

1.5流式细胞术检测凋亡率 取对数生长期的细胞接种于6孔板中(5×105个/ml)，经不同浓度刺囊酸处理24 h后，胰蛋白酶消化细胞，PBS洗涤，收集细胞再用1×缓冲液100 μl重悬，加入Annexin-V和碘化丙锭(PI)各5 μl。在流式细胞仪(BD FACSCantoⅡ)上检测。采集的数据用Flow Jo软件分析细胞凋亡情况，凋亡率=(早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数)/全部细胞数×100%。实验重复 3 次。

1.6Western印迹检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达 收集细胞，加入蛋白裂解液〔WIP 裂解液：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100∶1〕，裂解1 h后离心，吸取上清，加入上样缓冲液变性(99℃，7 min)，运用 BCA 蛋白测定试剂盒检测蛋白浓度。制备 10%的分离胶和浓缩胶，根据上述测定的蛋白浓度计算上样体积(20 μg总蛋白)，控制电压和时间(80 V，30 min；120 V，1 h)跑胶，湿转法转膜，聚偏氟乙烯(PVDF)膜孵育一抗(Bax和 Bcl-2，均 1∶1 000)4 ℃过夜，三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液(TBST)漂洗，加入二抗室温孵育 1 h，TBST 漂洗，置于自动显影仪(ChemiDocXRS成像系统)显影，并分析灰度值用于蛋白表达的统计。实验重复3次。

1.7统计学方法 应用 SPSS21.0 统计软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2 结 果

2.1刺囊酸对MCF-7细胞生长的影响 刺囊酸可显著抑制MCF-7生长，呈剂量和时间依赖性，相同时间不同剂量或相同剂量不同时间差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。刺囊酸抑制MCF-7生长在24、48、72 h的IC50分别为96.316、73.355、52.370 μmol/L。

2.2刺囊酸对MCF-7细胞增殖的影响 EdU阳性细胞率反应细胞增殖能力，0 μmol/L组细胞EdU阳性细胞率为(33.83±1.43)%，25、50、100 μmol/L的刺囊酸组分别为(25.83±1.43)%、(17.31±2.02)%和(10.47±1.85)%，与0 μmol/L组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1。

表1 不同浓度刺囊酸对MCF-7生长的抑制率比较

与0.0 μmol/L比较：1)P<0.05；与24 h比较：2)P<0.05

蓝色：DAPI染核，绿色：增殖的EdU阳性细胞图1 不同浓度刺囊酸对MCF-7细胞增殖的影响(×200)

2.3刺囊酸对MCF-7细胞凋亡的影响 0 μmol/L组凋亡率为(7.19±0.86)%，25、50、100 μmol/L的刺囊酸组凋亡率分别为(15.67±5.13)%、(29.00±4.10)%和(44.52±7.77)%，与0 μmol/L组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.4刺囊酸对MCF-7细胞凋亡相关蛋白的影响 随刺囊酸剂量增加，Bax蛋白表达显著增加(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.05)。Bax/Bcl-2比例显著增加(P<0.05)。见图2和表2。

图2 刺囊酸对MCF-7细胞中Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

剂量(μmol/L)BaxBcl-2Bax/Bcl-201.00±0.191.00±0.151.00±0.17251.41±0.211)0.82±0.141)1.72±0.161)501.86±0.131)2)0.62±0.101)2)3.00±0.121)2)1002.12±0.241)2)0.43±0.081)2)4.93±0.191)2)

与0 μmol/L组比较：1)P<0.05；与25 μmol/L组比较：2)P<0.05

3 讨 论

研究者从植物、动物、微生物中分离并鉴定出一系列具有强生理活性的天然产物，其中很大部分具有优良的抗癌活性〔6〕。从天然产物中筛选抗肿瘤药物已经成为治疗癌症的有效途径，例如，临床上应用广泛的抗肿瘤药物紫杉醇〔7〕和伊立替康(喜树碱衍生物)〔8〕。此外，多种天然产物正在进行抗肿瘤临床前研究。例如，葡萄中提取的多酚类化合物白藜芦醇〔9〕、绿茶茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)〔10〕等均表现出显著的抗肿瘤活性，有望发展成新型的抗肿瘤药物。

刺囊酸可通过破坏线粒体膜功能，促进细胞色素C释放进入胞质，从而诱导肝癌细胞HepG2凋亡〔3〕。刺囊酸促进人早幼粒白血病细胞HL-60的氧化应激产生大量的活性氧簇(ROS)，破坏线粒体膜功能，引起凋亡〔4〕。研究表明，刺囊酸对卵巢癌和子宫内膜癌也具有显著的抗癌作用，其可抑制SKOV3、A2780、OVCAR3 和HEC1A等细胞增殖〔5〕。本研究表明刺囊酸能抑制乳腺癌细胞的增殖，并促进其凋亡。

癌细胞的异常增殖和耐凋亡是肿瘤发生发展的重要病理过程。细胞凋亡受多种凋亡相关基因调控，其中Bcl-2基因家族是调控细胞凋亡的关键基因。促凋亡基因Bax和抗凋亡基因Bcl-2是Bcl-2基因家族中的重要成员〔11〕。癌细胞中Bcl-2表达较高，与Bax形成异源二聚体从而抑制凋亡，因此，癌细胞具有强力的耐凋亡能力。反之，当癌细胞受到抗癌药物刺激时，Bax表达增高，形成同源二聚体促进凋亡〔12〕。本研究发现，不同浓度刺囊酸促进MCF-7细胞凋亡。