莪术水提物通过上调notch1诱导口腔癌细胞凋亡

李浩渤 陈 勇 陈 宇

(河北医科大学第二医院口腔内科，河北 石家庄 050000)

目前对于口腔癌的治疗多采用放疗配合手术等手段〔1～3〕，这些复合疗法可以有效控制疾病发展，但副作用大，会对身体造成较大的负担。老年人各项身体功能相对较弱，在老年阶段发生口腔癌病变，复合疗法的使用受到明显的限制。传统中医药在使用过程中药效平和，毒副作用明显较低，在老年病、慢性病的治疗上具有极大的优势。中国药典记录，姜科植物莪术具有破血行气、消积止痛的作用〔4〕，临床上可以作为抗肿瘤药物，特别是抗早期宫颈癌的药物进行使用。现代药理研究证实莪术水提物及其多种有效成分对多种肿瘤有良好的抑制作用，可以直接抑制肿瘤细胞蛋白的合成〔5,6〕。本文旨在探究莪术水提物体内外对口腔癌细胞增殖的抑制作用，研究其对肿瘤细胞周期及notch1基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与动物 Tca8113口腔癌细胞，受赠于上海交通大学第二附属医院肿瘤科。KB口腔癌细胞购于美国模式培养物集存库(ATCC)。

NCR/Nu裸鼠，雌雄各半，SPF级，体质量18～22 g，共50只，购自河北省实验动物中心〔合格证号：SCXK(冀)20012-1-003〕。

1.2实验试剂、仪器与药物 RPMI1640培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(FBS，Gibco)，凋亡试剂盒(四正柏)，Trizol(Life Technology)，逆转录及荧光定量PCR试剂盒(Thermo)，培养瓶、培养皿等细胞实验耗材(Corning)。普通化学试剂均为国产分析纯(天津大茂)。 超净工作台(苏州苏净)，旋转蒸发仪(上海亚恒)；酶标仪(Thermo Scientific)，荧光定量PCR仪(ABI)，冷冻高速离心机(Thermo)，流式细胞仪(贝克曼)，分析天平(梅特勒)。莪术购于北京同仁堂，使用5倍体积蒸馏水煎煮，沸后1 h停止，使用旋转蒸发仪浓缩至生药量为5 g/ml。

1.3细胞培养 复苏口腔癌Tca8113和KB细胞株，从液氮中取出细胞后，置于37℃水浴锅中摇动迅速解冻，1 000 r/min，3 min离心后，使用新鲜的RPMI1640含有10%FBS重悬细胞，并接种于细胞培养瓶。待细胞生长置大部分铺满培养瓶，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆后，加入培养液终止消化，离心去除培养液加入新鲜培养液重悬，并传代于新的培养瓶中。冻存如传代，在离心去除培养液后使用含有10%FBS和10%二甲基亚砜(DMSO)的RPMI1640培养液重悬，加入冻存管并置于梯度冻存盒内，1 d后存于液氮。

1.4MTT法检测口腔癌细胞的增殖 取传1代的口腔癌细胞Tca8113和KB，调整细胞浓度为1×104，接种于96孔板中，每孔100 μl。12 h后，弃去细胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪术水提物的培养液。加入药物培养20 h后，加入10 μl MTT，4 h后使用酶标仪在570 nm处读取吸光度，计算抑制率。抑制率=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。

1.5流式细胞术检测口腔癌细胞的凋亡 取传1代的口腔癌细胞Tca8113，调整细胞浓度为5×106个/ml，接种于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，弃去细胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪术水提物的培养液。孵育24 h后，使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗离心，并加入70%的酒精固定细胞，按照凋亡试剂盒说明书分别加入PI及Annexin V-FITC染色细胞后，4℃保存直至上机检测。

1.6Q-PCR法检测口腔癌细胞notch1基因的表达 取传1代的口腔癌细胞Tca8113，调整细胞浓度为5×106个/ml，接种于6孔板中，每孔1 000 μl。12 h后，弃去细胞上清液，并加入配置好的含有0,1.25，2.50和5.00 μg/ml的莪术水提物的培养液。孵育24 h后，每孔加入1 ml Trizol，按照试剂盒说明书中的方法提取RNA，按照逆转录试剂盒方法逆转录成cDNA。按照Thermo Q-PCR试剂盒说明书进行notch1基因表达检测。notch1引物：5′-ATCACTGCCCAGGAAACAAC-3′和5′-GTCCAGCCATTGACACACAC-3′。扩增条件为95℃，15 min；94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40个循环。数据使用2-△△Ct法分析。

1.7NCR/Nu小鼠肿瘤模型制备与给药 取传1代生长至对数期的细胞，使用PBS重悬细胞，调整浓度置1×107个/ml。除对照组裸鼠外，使用酒精棉消毒裸鼠右前肢皮肤，按照0.2 ml/只接种裸鼠。每天观察肿瘤发生情况，排除未生长肿瘤小鼠9只，剩余小鼠随机分为模型组(7只)，莪术水提物低、中和高剂量组各8只。待肿瘤生长至3～6 mm时，莪术水提物低、中和高剂量组分别灌胃25，50和100 mg/kg药物，对照和模型组灌胃等量蒸馏水，共给药5 w。

1.8肿瘤体积和质量测定 于末次给药1 h后处死小鼠，分离肿瘤组织。使用千分之一游标卡尺检测分离皮下移植瘤的长直径(a)和短直径(b)，计算肿瘤体积和抑制率。肿瘤体积=ab2/2，体积抑制率=(1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积)×100%。测量完成后，使用清洁滤纸擦干净血迹，使用分析天平称重，计算肿瘤抑制率。质量抑制率=(1-实验组肿瘤质量/对照组肿瘤质量)×100%。

1.9Q-PCR法测定肿瘤组织notch1基因的表达 分离得到的肿瘤组织称重完成后，剪取100 mg置Trizol试剂内，按照试剂盒说明方法提取RNA，按照逆转录试剂盒方法逆转录成cDNA。notch1引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′和5′-CATGGGATATGACTGCTC-3′。扩增条件为95℃，15 min，94℃，15 s；60℃，25 s；72℃，30 s；40个循环。数据使用2-△△Ct法分析。

1.10统计学分析 使用SPSS21.0软件，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1莪术水提物对口腔癌细胞Tca8113和KB增殖的影响 与对照组比较，莪术水提物低、中、高剂量组Tca8113细胞的吸光度明显下降(P<0.05或P<0.01)，其抑制率分别为26.21%，42.89%和54.02%。与对照组比较，莪术水提物高剂量组KB细胞的吸光度明显下降(P<0.05)，其抑制率为19.18%。莪术水提物低、中剂量组KB细胞抑制率分别为10.10%、11.35%。见表1。

表1 莪术水提物对口腔癌细胞Tca8113和KB的抑制率吸光度A值，n=3)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2莪术水提物对口腔癌细胞Tca8113凋亡的影响 与对照组〔(2.51±0.02)%〕比较，莪术水提物高剂量组的口腔癌Tca8113细胞凋亡率明显增加〔(8.78±1.01)%，P<0.05〕，莪术水提物低、中剂量组凋亡率分别为〔(2.13±0.24)%，(4.72±1.90)%〕，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3莪术水提物对口腔癌细胞notch1基因表达的影响 与模型组(1.010±0.038)比较，莪术水提物中、高剂量组的notch1基因表达明显增加(1.337±0.101，1.477±0.108；P<0.05)。莪术水提物低剂量组notch1基因表达量为1.123±0.044，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4莪术水提物对口腔癌细胞Tca8113移植瘤小鼠在体肿瘤体积和质量的影响 与对照组比较，模型组的肿瘤体积和质量明显增加(P<0.01)。与模型组比较，莪术水提物中、高剂量组的肿瘤体积明显下降(P<0.05)，对肿瘤体积的抑制率分别为25.42%和46.65%；与模型组比较，莪术水提物中、高剂量组的肿瘤质量明显下降(P<0.05)，对肿瘤质量的抑制率分别为27.01%和42.98%。莪术水提物低剂量组对肿瘤体积的抑制率为7.07%，对肿瘤质量的抑制率为7.01%。见表2。

表2 各组小鼠在体肿瘤的体积和质量

2.5莪术水提物对口腔癌细胞Tca8113移植瘤小鼠notch1基因表达的作用 与对照组(1.010±0.038)相比，模型组notch1基因表达明显下降(0.643±0.017，P<0.01)。与模型组比较，莪术水提物中、高剂量组的notch1基因表达明显增加(0.698±0.091，0.747±0.075；P<0.05)。莪术水提物低剂量组nothch1基因表达量为0.662±0.013，与对照组及模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

中医认为肿瘤的发生和气滞血瘀证有关，活血化瘀类药物对于治疗癌症有着重要的作用〔7〕。莪术被证实是一种具有抗肿瘤作用的中药〔8,9〕，本研究对莪术抗口腔鳞状细胞瘤的作用进行了研究。

notch1基因在肿瘤的发生中表现出多种不同的作用，在不同的细胞类型和环境中，notch1基因可能出现促癌和抑癌的不同效果。有研究表明，notch1基因在皮肤癌、小细胞肺癌等癌症中可以作为抑癌基因存在，notch1基因上调可以起到诱导癌细胞凋亡和抑制细胞增殖的作用〔10,11〕。而在口腔癌组织样本中，notch1基因的表达显著性降低，因此增强notch1基因的表达、促进口腔癌细胞凋亡是口腔癌治疗的途径之一。本研究首先探讨了莪术水提物体外抑制口腔癌细胞株Tca8113和KB的作用，发现其对不同的细胞株作用效果不同，对Tca8113效果更强，提示莪术在临床应用时需要对症试药。因此，在之后进行莪术水提物对细胞凋亡及notch1基因表达影响的实验时，选择了Tca8113细胞进行深入研究。实验证实，莪术水提物可以诱导该种口腔癌细胞凋亡，并且能够起到在体抑制Tca8113细胞移植瘤生长的作用。同时，体外体内实验同时证实，莪术水提物可以上调notch1基因的表达，这是莪术水提物抑制口腔癌细胞增殖的作用机制之一。本研究结果证实，莪术水提物具有体内外抑制口腔鳞状细胞瘤的作用，而该作用与notch1基因表达的抑制有关。