ApN/TNF-α信号途径在有氧运动防治ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化过程中的抗炎症作用

吴卫东

(郑州大学体育学院，河南 郑州 450044)

动脉粥样硬化(AS)是一种常见的动脉血管疾病，严重威胁人类健康，其所致的心、脑血管疾病发病率和死亡率居各种疾病前列。AS病变特点是动脉管壁增厚变硬，管腔缩小并失去弹性，动脉内膜上聚集呈黄色粥样的脂质，主要累及弹性及大中等肌性动脉，一旦发展到阻塞动脉管腔，则导致动脉所供应的组织或器官缺血、坏死〔1〕。脂联素(ApN)是脂肪细胞分泌产生的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，是脂肪组织基因表达最丰富的蛋白产物之一。ApN与AS的发生发展密切相关，可多方位抑制AS性细胞改变。正常人血液中ApN水平显著高于AS患者〔2〕，所以AS的发生发展可能与血液中ApN水平的下降关系密切，同时对动物的研究发现ApN基因缺陷小鼠在血管受损后内膜较野生型小鼠明显增厚〔3〕。血清ApN水平不仅能预示AS的发生发展，并且在临床上表现出抗AS的作用，因此通过提高ApN mRNA表达和血清水平已经成为防治AS的一种新手段〔4,5〕。现有研究证实长期慢性炎症是导致AS的重要因素，其实质是动脉壁内皮细胞、平滑肌细胞损伤后的炎性纤维组织增生反应〔6〕。AS斑块中的巨噬细胞和泡沫细胞可以通过分泌肿瘤坏死因子(TNF)-α扩大血管壁的炎性反应，增加白细胞聚集，从而刺激血管黏附分子(VCAM)-1 mRNA表达增加，使内皮组织黏附更多的单核细胞，黏附的单核细胞还可移入内膜进一步转化为具有强氧化能力的巨噬细胞〔7〕。改变静态生活方式，适宜运动(有氧运动)是预防AS的有效手段，但关于运动预防AS的确切机制尚未完全阐明。本研究以ApoE-/-小鼠为动物模型，通过观察小鼠运动干预后主动脉血管壁结构的病理变化，探讨有氧运动在防治AS过程中ApN通过主动脉脂联素受体(AdipoR)1、TNF-α信号通路发挥抗炎症作用的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及方案 8周龄雄性ApoE-/-小鼠20只以二级条件饲养,小鼠购于北京大学医学部实验动物部〔合格证号：scxk(京)2006-2008〕，适应性饲养1 w后随机分为对照组(C)和运动组(E)，每组10只，两组小鼠均饲以高脂膳食饲料(21%猪油，0.15%胆固醇，78.85%普通饲料)〔8〕。E组小鼠每日上午9～10时进行跑台运动，递增运动强度和时间，每周5次〔9〕。小鼠由第1～5周 10 m/min，30 min，逐渐递增至13 m/min，60 min，并稳定此运动量至14周末。

1.2取材 运动结束后所有小鼠麻醉，心尖取血，制备血清。心脏血管在体经焦碳酸二乙酯(DEPC)水灌流后取出全心脏和主动脉，取附睾、肾周脂肪垫和腓肠肌，DEPC水冲洗，用滤纸吸干后称重。取材前E组小鼠停止运动48 h，禁食过夜。

1.3测试指标和方法 主动脉病理观察：全心脏标本经4%多聚甲醛固定4 h，然后聚乙二醇和聚乙二烯醇的水溶性混合物(OCT)包埋进行冰冻切片，切片厚度10 μm并进行苏木精-伊红(HE)染色，镜下观察主动脉病理形态。血清ApN含量测定：双抗夹心酶联免疫(ABC-ELISA)方法，试剂盒购于美国R&D公司。ApN mRNA测定：采用RT-PCR法检测。Trizol一步法提取总RNA，采用两步法反转录试剂盒进行反转录，试剂盒由美国Amresco公司提供，循环30次。引物序列检索自NCBI-Nucleotide数据库，采用Primer5.0软件设计，由上海生工生物工程技术公司合成，ApN上游引物：5′-AATCATTATGACGGCAGCAC-3′，下游引物：5′-CCAGATGGAGGAGCACAGAG-3'；β-actin扩增产物长度511 bp，上游引物5′-CCATCTACGAGGGCTATGCT-3'，下游引物5'-CAAGAAGGAAGGCTGGAAAA-3'。主动脉AdipoR1、TNF-α蛋白测定：采用Western印迹方法检测。取100 mg腓肠肌充分剪碎加入裂解液，匀浆后离心(16 000/min，30 min)取上清液，测定蛋白浓度。调整上样量后，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离，用湿转法将目的蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5%的脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗涤后加一抗(抗体分别购自美国Abcam公司和Santa cruz公司)4℃过夜。封闭-洗涤缓冲液(TBST)冲洗3次，加碱性磷酸酶标记的二抗1∶3 000稀释液孵育1 h后显色，以各细胞因子与β-actin的比值作为相对表达量。

1.4统计学分析 采用SPSS14.0数据软件包进行t检验。

2 结 果

2.1体重及体成分 根据附睾脂肪垫和肾周脂肪垫重量与体重的计算出的脂体比是反映机体内脂肪含量的指标。C、E两组小鼠绝对体重无显著变化〔分别为(37.25±2.40)g、(36.71±2.69)g〕，脂体比E组(2.53±0.38)小鼠显著低于C组小鼠(3.64±0.49，P<0.05)，表明长期有氧运动虽未显著影响ApoE-/-小鼠AS形成过程中的体重，但显著减少了小鼠内脏脂肪积累，改善了脂体比。

2.2主动脉血管壁病理观察 C组小鼠主动脉血管壁纤维板分裂出现间隙，呈多层状，内膜增厚且失去原有的波浪状，镜下可见泡沫细胞浸润和纤维斑块，甚至斑块有破裂出血，内膜被淋巴细胞、炎性细胞浸润，可见大量胆固醇结晶，显示出易损斑块的特征。E组小鼠主动脉血管壁弹力纤维排列相对C组小鼠致密，内膜轻度增厚，偶有断层，可见少量脂质斑块和泡沫细胞，病变程度较C组明显减轻，见图1，表明有氧运动对ApoE-/-小鼠AS的发生、发展具有明显的抑制和延缓作用。

图1 各组小鼠主动脉窦横截面HE染色观察(×100)

2.3脂肪组织ApN mRNA和血清ApN含量 E组小鼠脂肪组织ApN mRNA表达(1.92±0.10)及血清水平〔(0.59±0.07)mg/L〕显著高于C组小鼠〔(1.23±0.11)、(0.43±0.05)mg/L，P<0.05〕。表明有氧运动可以显著提高ApoE-/-小鼠脂肪组织ApN mRNA的表达和血清ApN水平。

2.4主动脉AdipoR1、TNF-α蛋白表达 E组小鼠主动脉AdipoR1蛋白显著高于C组〔(1.31±0.15)vs(0.98±0.11)，P<0.05〕，E组小鼠主动脉TNF-α蛋白显著低于C组〔(0.92±0.09)vs(1.15±0.10)，P<0.05〕，见图2，表明有氧运动显著提高了主动脉AdipoR1蛋白表达，抑制了主动脉TNF-α蛋白表达。

图2 Western印迹检测主动脉AdipoR1、TNF-α蛋白表达

3 讨 论

本研究发现有氧运动对已形成的AS病变有一定延缓作用，但有氧运动并不能逆转已形成的AS。载脂蛋白(Apo)E的缺失会导致循环血液中胆固醇的积累而诱发AS〔8〕，ApoE-/-小鼠就是利用基因敲除技术，造成血液中胆固醇清除困难而不需要高脂饮食就会自发形成AS，且产生的AS斑块，病变位置、病变过程与人类极为相似〔10,11〕。

ApN mRNA表达水平受多种因素影响，例如年龄、性别和环境等，运动是大量影响因素中重要的一个。有氧运动一旦确定合适的研究对象且制定有效的运动强度、采用适宜的运动方式和控制合理的运动时间就可以显著提高ApN mRNA表达水平。ApN是脂肪组织合成分泌的细胞因子，但人体不同部位脂肪组织ApN含量和分泌存在显著差异，影响ApN水平的主要因素是内脏脂肪组织〔12,13〕，然而ApN基因表达水平随内脏脂肪组织减少而升高。本实验结果提示有氧运动虽未显著改变小鼠的绝对体重，但可以有效控制其内脏脂肪积累，同时有氧运动可以显著提高小鼠脂肪组织ApN表达和血清ApN含量，这可能是有氧运动通过减少内脏脂肪积累而增强了脂肪组织ApN的合成与分泌。分析其机制一方面可能是炎症因子TNF-α的表达量随内脏脂肪组织减少而降低，从而解除了TNF-α的高表达对ApN mRNA表达的抑制；另一方面可能是模型组小鼠外周的保护性消耗增多，同时代偿性下降导致了ApN水平低于运动组小鼠。

本实验发现有氧运动增强了小鼠主动脉AdipoR1蛋白的表达，降低了TNF-α蛋白的表达水平，提示有氧运动可能通过增强ApN活动水平抑制了主动脉TNF-α介导的炎症反应。炎症反应在AS的发生、发展过程中发挥着重要作用，血管壁最初的炎症反应是通过炎症细胞的增生达到保持机体内环境稳定的目的，从而实现对血管损伤的保护，但是血管壁炎症如不能及时消除则会对内皮组织和血管造成破坏，引发斑块破裂及血栓等并发症〔14,15〕。TNF-α的激活是炎症激活的重要步骤之一，是炎症反应过程中的关键调节因子，参与了众多心血管疾病的发生和发展〔16〕。内皮细胞被TNF-α激活后可增强单核细胞的黏附，这是血管性疾病发生发展的关键性步骤〔17〕。ApN可通过调节内皮细胞的炎症反应发挥抗AS的作用，分析其机制可能有以下两方面：一是ApN与主动脉AdipoR1结合后可增加周围组织的胰岛素敏感性。胰岛素敏感性的增加可以阻断TNF-α诱导NF-κB抑制蛋白磷酸化及NF-κB的激活，从而抑制黏附分子的表达，发挥保护血管壁和延缓AS斑块发展的作用；二是ApN与主动脉AdipoR1结合后可抑制主动脉白细胞介素(IL)-6的表达。炎症因子IL-6可以诱导内皮细胞产生急性反应蛋白，对宿主自身破坏性炎症有增强作用；IL-6还可进一步激活主动脉TNF-α信号系统，从而形成正反馈的级联放大效应，使炎症反应加强〔18〕。由此推测，有氧运动通过ApN抑制IL-6表达阻断了TNF-α信号途径，减少了相关炎症因子的表达，发挥了保护主动脉的作用。