Nuc和mecA基因在金黄色葡萄球菌及其甲氧西林耐药性检测中的初步应用

刘莉 ，李变利 ，路子玉 ，马伟玲 ，纪昌 ，刘国辉 ，张红梅 ，贺亚玲 ，吴万贵 ，曹旭东 *

（1石河子大学医学院，新疆 石河子 832000；2石河子经济技术开发区医院，新疆 石河子 832000；3石河子大学医学院第一附属医院检验科，新疆 石河子 832000）

金黄色葡萄球菌在自然界分布广，不仅能造成机体各种器官的化脓性感染、败血症、脓毒血症，而且它的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征、毒素休克综合征等多种感染性疾病[1]。

近年来，金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药情况日益严重，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphyococcus aureus，MRSA） 的出现及传播流行，使之成为医院内感染和社区感染中常见的病原菌之一。MRSA不但对甲氧西林耐药，而且对所有β-内酰胺类抗生素及其他多种抗菌药物耐药，因此常被称为“超级细菌”。MRSA感染率逐年攀升，以其难治和高病死率等特点，与艾滋病、乙型肝炎被列为世界三大感染性顽疾，已成为世界范围内的公共卫生问题。因此，了解金黄色葡萄球菌的耐药机制，快速鉴别MRSA，对感染的控制和治疗十分重要。本研究通过对本地医院的金黄色葡萄球菌临床分离株进行耐药性检测，掌握其耐药性信息，筛选获得MRSA，通过PCR技术扩增甲氧西林耐药相关基因，对PCR技术直接检测葡萄球菌及其甲氧西林耐药性进行分析评估。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

63株金黄色葡萄球菌来自于2016年7月至2016年12月新疆某医院检验科分离鉴定的标本，标本主要来源于烧伤科、ICU、骨科、肿瘤内科等科室。

1.1.2 药敏纸片

头孢西丁（30 μg），苯唑西林（1 μg），青霉素（10 μg），利福平（5 μg），万古霉素（30 μg），均购自英国OXOID公司。

1.1.3 引物

针对金黄色葡萄球菌nuc、mecA、基因序列，设计上、下游引物，由苏州泓迅生物科技有限公司进行合成。所用引物序及扩增产物预期长度见表1。

表1 PCR实验所用引物Tab.1 Primer for PCR experiments

1.1.4 主要仪器设备

Sensoquest Lascycler牌PCR仪为德国SENSO公司生产，DYY-6C型双稳定时电泳仪和DYCP-31DN型电泳槽均为北京六一生物科技有限公司生产，Gel DocXR+凝胶成像仪为美国BIO-RAD公司生产，Hereus PICO21离心机为德国Thermo Fisher公司生产。

1.2 方法

1.2.1 标本处理

参照文献[2]方法，将收集到的金黄色葡萄球菌标本，接种于20 mL的L-B液体培养基中，于37℃环境中震荡培养12 h后，用四分区划线法接种于固体培养基上，培养12-18 h后观察菌落的颜色，进一步进行革兰染色后细菌的形态学观察。

1.2.2 药敏实验

金黄色葡萄球菌药敏实验依据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的 Kerby-Bauer纸片扩散法（K-B法）进行，结果按CLSI推荐的标准判定敏感、耐药或中介[3]。

1.2.3 制备PCR实验的DNA模板

取1 mL金黄色葡萄球菌菌液，置于1.5 mL的EP管中，离心，弃上清液，于沉淀中加入500 μL的0.9%生理盐水重悬后，离心，洗涤2次后，弃上清液，于沉淀中加入500 μL双蒸水后，重悬，经100℃水浴10 min后，留上清液作为PCR实验的金黄色葡萄球菌基因组DNA模板（-20℃保存）。离心条件均为12000 r/min，离心2 min。

1.2.4 PCR扩增nuc基因和mecA基因

采用PCR技术对 63株实验菌株的nuc基因和mecA基因分别进行扩增，PCR反应体系总体积为 25 μL，包括 9.7 μL dd H2O；上、下游引物（25 μmol/L） 各 0.4μL， 模板2μL，Taq MasterMix 12.5 μL。

PCR反应条件为 95℃预变性5 min；94℃变性40 s，对应温度下退火30 s，72℃延伸 1 min，重复30个循环；最后72℃延伸 7 min；4 ℃保存。每个反应同时做一个重复。

1.2.5 电泳分析

PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结果用凝胶成像系统进行观察分析。

2 结果

2.1 菌株形态学观察结果与菌株科室分布

经观察菌落的颜色为淡桔黄色，细菌经革兰染色后镜下观察，细菌呈G+，葡萄串状排列，无芽孢，无鞭毛。所收集的63株菌均符合金黄色葡萄球菌的特征。

2.2 实验菌株nuc基因的PCR检测结果

对临床分离株进行nuc基因的PCR扩增，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小约800 bp的DNA片段，与预期值相符（图1）。实验菌株中有54株能通过PCR技术检测出nuc基因，检出率为85.7%（54/63）。

图1 不同菌株nuc基因的扩增结果Fig.1 PCR amplification of nuc gene

2.3 药敏试验结果

依据美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的Kerby-Bauer纸片扩散法（K-B法）对63株金黄色葡萄球菌进行头孢西丁、苯唑西林、青霉素、利福平、万古霉素等抗生素的药敏试验，结果见表2。

表2 63株金黄色葡萄球菌临床分离株对5种抗菌药物敏感性测试结果Tab.2 Antibiotic susceptibility test results of 63 S.aureusclinical isolates

从表中可见本实验所用的金黄色葡萄球菌临床分离株对头孢西丁、苯唑西林、青霉素、利福平、万古霉素的耐药率分别为38.10%、23.81%、98.41%、6.35%和0。对青霉素的耐药率最高，接近100%。发现1株为万古霉素中介耐药。以头孢西丁耐药为参考标准，本实验所用的金黄色葡萄球菌临床分离株中，MRSA有 24株，占 38.10%（表 2）。

进一步分析这24株MRSA的药敏试验数据，结果显示24株MRSA对苯唑西林、青霉素、利福平、万古霉素的耐药率分别为 62.50%、100%、16.67%和0，均高于63株实验菌株的对应抗生素的总体耐药率；也高于39株MSSA的对相应抗生素的耐药率；24株头孢西丁耐药分离株中，有8株对苯唑西林敏感，1株对苯唑西林中介耐药（表3）。

表3 24株MRSA与39株MSSA对4种抗菌药物敏感性测试统计Tab.3 Susceptibility test results of four kinds of antibiotics in 24 stains of MRSA and 39 stains of MSSA

若以苯唑西林耐药为参考标准，本实验所用的金黄色葡萄球菌临床分离株中有15株为MRSA，占23.81%。

进一步统计分析这15株MRSA的药敏试验数据，结果与以头孢西丁耐药为参考标准判断MRSA所统计的药敏试验结果不完全一致，其中只有3株对利福平耐药，另外，有9株MSSA对头孢西丁耐药（表 4）。

表4 15株MRSA与48株MSSA对4种抗菌药物敏感性测试统计Tab.4 Susceptibility test results of four kinds of antibiotics

由于以头孢西丁耐药为参考标准判断MRSA，能更好地体现MRSA的多耐药性，并且CLSI推荐用头孢西丁替代苯唑西林检测MRSA，本文后续内容均采用此标准进行分析。进一步统计MRSA和MSSA菌株中nuc基因携带情况，发现MRSA菌株的nuc基因携带率为87.50%（21/24），MSSA菌株的nuc基因携带率为 84.62%（33/39）（表 5）。

表5 MRSA和MSSA菌株中nuc基因分布情况Tab.5 Distribution of nuc Gene in MRSA and MSSA strains

2.4 耐药相关基因PCR检测结果

利用PCR技术，对本实验的63株金黄色葡萄球菌中耐药相关基因MecA基因进行检测，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小约600 bp的DNA片段，与预期值相符，结果见图2。

图2 不同菌株MecA基因的扩增结果Fig.2 PCR amplification of MecA gene

本实验63株金黄色葡萄球菌携带mecA基因的菌株共有12株，携带率为19.05%。其中24株MRSA有12株携带mecA基因，携带率为50.0%；39株MSSA中均不携带mecA基因（表6）。

表6 MRSA和MSSA菌株中mecA基因分布情况Tab.6 Distribution of mecAGene in MRSA and MSSA strains

表7 mecA基因阴、阳性菌株中nuc基因的分布Tab.7 Distribution of nuc Gene in mecA negative and positive strains

进一步分析nuc基因在mecA基因阳性与阴性临床分离株中的携带情况，发现mecA基因阳性临床分离株中nuc基因的携带率为 91.67%（11/12），mecA基因阴性临床分离株中nuc基因的携带率为84.31%（43/51）（表 7）。

由于本实验样本中近一半的临床分离株来自重症医学科、烧伤整形科、骨科，并且检测出的MRSA有17株，占本实验检测到MRSA的70.83%。重症医学科、烧伤整形科和骨科样本中同时携带mecA基因和nuc基因的MRSA临床分离株共有9株。

3 讨论

近年来，金黄色葡萄球菌对抗生素的耐药情况日益严重，自1961年世界上首次报道MRSA感染后，世界不同地区报道的MRSA菌株不断增多。全国细菌耐药监测网的统计显示，2016年我国MRSA检出率为38.4%，各省MRSA检出率在9.3%-75.3%之间[4]。

MRSA耐药机制非常复杂，目前，MRSA对β-内酰胺类药物耐药较为清楚的机制有两个[5]，其一是金黄色葡萄球菌获得β-内酰胺酶基因后，产生大量的β-内酰胺酶，可水解β-内酰胺类抗生素，使细菌表现出耐药性。耐药基因靠质粒传递，既在葡萄球菌与葡萄球菌之间，也在葡萄球菌与链球菌之间通过基因传递扩大而耐药，这种耐药表现出均一性。其二是MRSA获得了mecA基因，该基因编码产生一种新的青霉素结合蛋白(Penicillin—binding proteins，PBPs)，称为 PBP2a，为一种转肽酶，对现有β-内酰胺类抗菌药物亲和力很低。当正常PBPs被β-内酰胺类药物结合而失去活性时，PBP2a能代替正常PBPs，行使肽聚糖合成功能，维持金黄色葡萄球菌的生长和成活，表现为高度耐药，这种耐药常呈不均一性，且β-内酰胺酶抑制剂对其无效。mecA基因的表达受mecR1、mecR2和mecI基因的调控，同时还受到blaR1和blaI基因的影响。有研究[6]显示，PBP2a合成的肽聚糖交联程度减少，可强烈刺激巨噬细胞产生炎症小体和大量的IL-1β，加重感染部位的病情。MRSA不但对甲氧西林耐药，而且对多种抗菌药物耐药。MRSA感染率逐年升高，由于这种感染难治、费用高和病死率高，因此，了解金黄色葡萄球菌临床分离株的耐药特征，建立快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性的方法，对控制和治疗金黄色葡萄球菌感染有重要意义。

从传统药敏测试结果来看，本实验所用的63株金黄色葡萄球菌临床分离株对抑制细菌细胞壁肽聚糖合成类抗生素中青霉素的耐药率高达98.41%，对头孢西丁、苯唑西林的耐药率分别为38.10%、23.81%。对抑制细菌蛋白合成类抗生素中利福平的耐药率为6.35%。CLSI推荐用头孢西丁替代苯唑西林检测MRSA，以此为标准，本实验中MRSA的检出率为38.10%，与全国同期平均水平接近。

耐热核酸酶由致病性葡萄球菌产生，临床上已将耐热核酸酶作为测定葡萄球菌有无致病性的重要指标之一[1]。由于编码该酶的nuc基因高度保守，有学者利用PCR技术扩增nuc基因进行致病性的金黄色葡萄球菌的快速鉴别[7-10]，本实验对63株金黄色葡萄球菌临床分离株进行nuc基因的扩增，发现该基因的检出率为85.7%，低于相关报道的检出率[7，8]。本实验24株MRSA临床分离株中有21株携带nuc基因，携带率为87.50%；39株MSSA临床分离株中有33株携带nuc基因，携带率为84.62%。

有学者用PCR技术检测mecA基因作为在分子水平判断MRSA的“金”标准，金黄色葡萄球菌检出mecA 基因或产PBP2a即可定为MRSA[11-12]。本实验结果显示，24株头孢西丁耐药临床分离株中有12株携带mecA基因，携带率为50.0%；39株头孢西丁敏感株中有0株携带mecA基因。若以金黄色葡萄球菌是否携带mecA基因为标准判断MRSA，本实验样本中MRSA的检出率为19.05%，与2016年全国细菌耐药监测网统计的新疆地区检出率（21.6%）接近。

总体上看，本实验所用菌株来自重症医学科、烧伤整形科的样本比例较高，63株金黄色葡萄球菌临床分离株中，nuc基因的检出率为85.7%；并非每一株都携带该基因，不携带该基因的菌株既有MRSA也有MSSA，不能忽视未携带nuc基因的金黄色葡萄球菌临床分离株。因此，如果仅用PCR技术扩增nuc基因来快速鉴定菌株是否为金黄色葡萄球菌可能存在一定程度的假阴性结果。

耐药表型检测结果显示，本实验菌株对青霉素几乎全部耐药，MRSA的检出率为38.10%，表现出多耐药特征。其中，来自重症医学科的临床分离株有 56.25%（9/16）为MRSA，这些菌株是否具有共同的传染源尚待分子流行病学研究证实。mecA基因检测的结果显示，通过耐药表型检测获得的MRSA中仅有50.0%的菌株携带mecA基因。有学者的研究显示[13]，用PCR技术扩增mecA基因时，有 9.8%的MRSA为mecA基因阴性。重症医学科、烧伤整形科和骨科样本中，MRSA同时携带mecA基因和nuc基因的比例分别为77.78%、50.0%和0。近期的研究证实[14-17]，多药外排（multi-drug efflux，MDE）基因表达、青霉素结合蛋白PBP1、2、3、4基因编码区突变及其启动子突变均可导致mecA基因阴性的金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药。另外，有文献报道[18]，在自然发生的mecA基因阳性且苯唑西林敏感的黄色葡萄球菌中，发现mecR1基因和blaR1基因突变丧失功能，mecA基因不能表达，导致菌株对苯唑西林敏感。因此，如果仅用PCR技术扩增mecA基因来快速鉴定金黄色葡萄球菌是否为MRSA可能存在较高比例的误诊。

尽管传统药敏试验操作复杂，并且耗时较长，但是，其结果应当作为临床用药的重要参考，尤其是MRSA中mecA基因携带率较低的地区，不宜仅凭PCR扩增mecA基因的结果来鉴定MRSA。由于本次实验中重症医学科的样本较多，MRSA比例较高，同时携带mecA基因和nuc基因的比例高，耐药性和致病性强，提示医护人员应在工作中加强消毒工作，避免自身感染和交叉感染，防止MRSA传播。

致谢：感谢石河子大学陈创夫教授为本实验提供的帮助。