纳米TiO2对雄性小鼠肾脏毒性作用的研究

刘龙龙，宋关玲*，牛 强，马儒林，丁玉松，万真真，曾宏梅，林 霖

（石河子大学医学院，新疆 石河子 832000）

纳米TiO2具有较好的光催化活性、抗菌能力强等优点，因而广泛应用于电子产品、造纸、护肤品、食品和医药等诸多领域[1-3]。然而这些便利的应用也伴随着人们对其对生物安全性的担忧。纳米TiO2可以通过皮肤、呼吸道以及消化道等途径进入体内，并在肝脏、肾脏以及脾脏等器官中蓄积，进而使组织产生氧化损伤、炎症反应等[4]。近年来，对纳米TiO2的毒性研究主要集中在急性毒性效应和长期毒性效应层面[5-8]，对其亚急性毒性方面的研究鲜有报道。为此我们以雄性小鼠肾脏为靶器官，初步探究纳米TiO2对雄性小鼠肾脏的亚急性毒性效应。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

主要仪器设备有酶标仪（美国 Bio-Rad公司），手动玻璃匀浆器（上海生物工程公司），高速冷冻离心机（上海安亭化学仪器厂）。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-PX)、丙二醛(MDA)、尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）和蛋白定量试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。锐钛型纳米TiO2（5-10 nm）购自上海晶纯生化科技股份有限公司。

1.2 实验动物分组及染毒方法

SPF级雄性ICR小鼠购自新疆医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（新）2011-0003，小鼠 4-5周龄，体重 22～25 g。饲养环境为室温（25±3）℃，相对湿度50%±10%，动物自由饮水摄食，适应饲养一周。将小鼠随机分为4组，每组15只，纳米TiO2以PBS为辅剂制备悬液，超声分散30 min后使用涡旋振荡器充分混匀，以10、50和100 mg/kg BW剂量进行连续灌胃染毒30 d，对照组仅给予PBS。

1.3 检测指标

1.3.1 肾脏脏器系数的测定

染毒结束后，处死雄鼠，快速分离肾脏，称量并计算脏器系数［小鼠肾脏系数=肾脏重量（g）/小鼠体重（g）×1000‰］。

1.3.2 肾脏氧化应激指标测定

准确称量待测肾脏重量，按照重量（g）:体积（mL）=1∶9的比例加入9倍体积的生理盐水，冰浴条件下机械匀浆，2000 r/min，离心10 min。取上清测定SOD、GSH-PX、MDA指标。测定严格按照说明书进行。

1.3.3 肾功能指标测定

组织匀浆制备方法同1.3.2。取上清对Cr、BUN、UA含量进行测定，测定严格按照说明书进行。

1.4 肾脏组织病理学评估

脱颈处死小鼠后，迅速取出肾脏，将部分组织固定在4%中性甲醛中，蜡块包埋，切片，经过HE染色后，光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.5 统计学分析

图1 纳米TiO2引起的氧化应激Fig.1 The oxidative stress induced by Nano-TiO2

运用SPSS11.9软件进行统计学分析，各组数据均以均数±标准差（±S）表示。多组间比较采用方差齐性检验和单因素方差分析。若方差齐，比较每组实验数据和对照组的差异应用Dunnet检验，反之则用秩和检验。P＜0.05表示差异显著，有统计学意义。

2 结果

2.1 肾脏脏器系数

同对照组相比较，随着纳米TiO2剂量的增加，小鼠肾脏脏器系数逐渐增加，但差异不具有统计学意义（P＞0.05）（表 1）。

表1 纳米TiO2对雄性小鼠肾脏系数的影响 ±STab.1 The effect of nano-TiO2on the kidney coefficient n=15，S

表1 纳米TiO2对雄性小鼠肾脏系数的影响 ±STab.1 The effect of nano-TiO2on the kidney coefficient n=15，S

组别/（mg/kg） 体重/g 肾重/g 肾脏系数/‰0 43.66±1.40 0.34±0.03 7.27±0.62 10 42.37±4.53 0.31±0.05 7.38±0.88 50 42.97±3.18 0.33±0.02 7.77±0.56 100 42.54±3.08 0.33±0.06 7.88±0.91

2.2 小鼠肾脏氧化应激指标的测定结果

与对照组相比，100 mg/kg BW染毒组SOD活性下降明显，具有显著性差异（P＜0.01）（图 1A）；各染毒组GSH-Px活性与对照组相比，差异均不具有统计学意义（P＞0.05）（图 1B），各染毒组 MDA 含量与对照组相比显著升高（P＜0.01）（图 1C）。

2.3 小鼠肾功能指标的测定结果

各染毒组小鼠肾组织肌酐（Cr）含量随着剂量的升高而逐渐降低，10 mg/kg BW 染毒组Cr含量低于对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）（图 2A），当染毒剂量升高到50和100 mg/kg BW时，肾脏Cr含量显著降低（P＜0.01）（图 2A）。与对照组相比，各染毒组肾脏BUN、UA含量差异均不具统计学意义（P＞0.05）（图 2B，图 2C）。

图2 纳米TiO2暴露对肾功能指标的影响Fig.2 The influence on the index of renal function after Nano-TiO2exposure

2.4 组织病理学

与对照组小鼠肾脏组织相比，10 mg/kg BW染毒组中，可见少量炎细胞浸润；50 mg/kg BW染毒组，观察到炎细胞浸润，间质充血以及肾小管之间的间隙变宽；100 mg/kg BW染毒组观察到间质纤维素样坏死、肾小球萎缩、肾小管官腔间隙增大以及部分肾小管细胞脂肪空泡。黄色圆圈表示炎细胞浸润，红色圆圈表示间质充血，黑色圆圈表示组织纤维化，绿色箭头表示细胞坏死，黄色箭头表示脂肪空泡，红色箭头表示肾小管管腔间隙增大（图3）。

图3 纳米TiO2暴露后观察肾脏的组织病理学变化（×200）Fig.3 The histopathological changes after the exposure of Nano-TiO2（×200）

3 讨论

纳米TiO2进入体内，大部分通过肾脏随尿液排出体外[9]，肾脏承担着较高的负荷，因此极为有必要针对纳米TiO2对肾脏的生物安全性予以评估。然而，目前大多数研究集中在慢性、亚慢性以及急性毒性研究，对于亚急性毒性阶段急需展开充分研究。基于以上现状，我们研究了亚急性染毒阶段纳米TiO2对雄性小鼠肾脏的毒性。

目前普遍认为，氧化应激在纳米TiO2引起的毒性效应中扮演重要的“角色”，纳米TiO2进入体内主要引起组织产生氧化应激，造成氧化损伤[10-11]。本实验结果显示，随着染毒剂量的升高，染毒组小鼠肾脏的SOD和GSH-PX活性逐渐降低，100 mg/kg BW染毒组的SOD活性与对照组相比显著下降；各染毒剂量组的MDA水平较对照组显著升高。SOD和GSH-PX参与维持机体的氧化-抗氧化平衡[12-13]，两种酶的活性减弱，表明机体清除自由基的能力减弱，进而表明肾脏受到自由基的攻击程度加深。膜脂质发生过氧化的主要产物是MDA，MDA含量增强表明肾脏组织脂质过氧化作用增强。体外实验发现，纳米TiO2染毒处理人体肾脏细胞（HEK-293），染毒组HEK-293细胞ROS水平升高，GSH和SOD水平降低，脂质过氧化水平升高[14]。体内实验中，对雄性小鼠经口灌胃纳米TiO2(2.5，5，10 mg/kg BW)6个月，染毒组小鼠肾脏组织MDA含量显著增加[15]。此外，组织病理学观察，发现随着纳米TiO2染毒剂量的增加，肾脏组织出现不同程度的损伤。王燕等[16]的研究中也发现小鼠肝肾出现组织病理学变化。这证明在亚急性毒性阶段，纳米TiO2确实可以引起雄性小鼠肾脏氧化损伤。

当肾功能正常时，BUN和Cr可以滤过肾小球进入尿液；当肾小球滤过率下降时，体内BUN和Cr含量下降[17]。本研究中并未发现BUN和UA有明显变化，这表明纳米TiO2尚未引起肾功能损伤。同时需要指出的是，Cr的含量呈现降低趋势，对于造成其含量下降的原因有待于进一步探索。

综上所述，我们的研究表明纳米TiO2暴露雄性ICR小鼠可引起小鼠肾脏组织的氧化损伤，并且对肾功能产生潜在影响。这提示我们将纳米TiO2应用于食品、医药、化妆品领域时应当严格规范其添加标准，这些纳米TiO2将会与人体直接接触，其生物安全性不容忽视。此外，从事纳米TiO2生产工作中的工人长期暴露在一个纳米TiO2浓度较高的环境中，其承担的安全风险远远高于普通人员，这需要引起我们的重视。我们的研究为进一步研究纳米TiO2引起的肾脏毒性机制奠定了基础，为安全接触纳米TiO2提供了一定的参考和实验依据。同时需要指出的是，纳米材料种类多，暴露人群的途径不单一，暴露时间漫长，这些因素都给人类健康带来更多的不确定性。因此，对有关于纳米材料生物安全性评价的研究工作的投入刻不容缓。