1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠足细胞的保护作用

刘馨馨 ，赵丹 ，陈亚茹 ，杨晓萍 ，黄瑾 ，罗星 *

（1石河子大学医学院，新疆 石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院，新疆 石河子832002）

慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是一种以肾小球为主的肾脏微结构变化为主要特征的肾功能日渐丧失的临床常见慢性疾病。目前CKD已成为一个日益增长的全球公共卫生问题，全球慢性肾脏病患病率大约为8%～16%，相当于近5亿患者受慢性肾病的影响[1]，估算到2020年5000万人将死于慢性肾脏疾病[2]。CKD阶段的评估可以帮助患者根据其肾功能恶化的风险进行分层，蛋白尿是肾病发展进程的诊断和治疗目标，且蛋白尿和微量元素的丢失是评判慢性肾病的有效指标，足细胞病变和足细胞凋亡是导致大量蛋白尿的重要组织病理学改变[3]。足细胞裂孔隔膜蛋白nephrin的缺失是足细胞损伤的早期生物标志，用于预测预后不良[4]。研究表明，针对足细胞不同的损伤路径，选择合适的治疗方案是实现治疗慢性肾病的精密医学目标。因此解决慢性肾脏病肾脏损伤这一问题的关键是探索有效的治疗足细胞损伤的方法，以减轻肾损伤并防止其进展至终末期肾病[5]。

1,25-(OH)2D3被称为“阳光维生素”，是维持人体生命所必需的营养素之一，人体内的1,25-(OH)2D3与许多疾病的发病机制密切相关，近年来，1,25-(OH)2D3在免疫功能、炎症、血管生成和衰老等方面的重要作用已经得到证实，甚至在乳腺癌、结直肠癌等癌症中有抗肿瘤作用[6-7]。细胞内特异性维生素D受体介导在1,25-(OH)2D3的生物学效应中承担着重要的作用[8]。临床研究和动物实验表明在慢性肾脏病早期就存在1,25-(OH)2D3的产生和分泌降低,其分泌降低又进一步加重了肾功能损害,从而行成恶性循环[9]。

随着1,25-(OH)2D3生物学效应研究受到越来越多研究学者的青睐，其在肾小球疾病的保护作用得到进一步认识，因而,早期补充1,25-(OH)2D3可能是有效延缓慢性肾脏病进展的有效策略之一。

本研究利用阿霉素来诱导SD大鼠，建立慢性肾病动物模型，造模成功后给予活性维生素D3干预，观察其在动物模型中对阿霉素导致的足细胞和肾损伤的保护作用，并验证其是否通过调节nephrin蛋白表达发挥这种作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要药品与试剂

注射用盐酸多柔比星：浙江Hisun药业股份有限公司，国药准字H20041318，规格：10 mg/支。骨化三醇胶丸：上海罗氏制药有限公司，国药准字J20150011，规格 0.25 μg/粒。水合氯醛（分析纯）：天津市福晨化学试剂厂，批号20130412。nephrin一抗：美国abcam公司，产品代码ab183099。免疫组化二步法检测试剂盒：北京中杉金桥生物有限公司，产品代码PV-9000。

1.1.2 仪器

TGL-16B离心机：上海安亭科学仪器厂；AU640全自动生化分析仪：日本Olympus公司；GL124-1SCN电子秤：德国Sartorius公司；H-600透射电子显微镜：日本日立公司；BX43光学显微镜：日本Olympus公司。

1.1.3 实验动物

6周龄 SPF级雄性成熟 SD大鼠（200-220g）90只，由新疆医科大学动物中心提供[许可证号：SCXK（新）2013-0001]。

1.2 方法

1.2.1 分组及阿霉素肾病大鼠模型制备

将90只雄性SD大鼠随机分为模型组、治疗组和对照组，每组30只。适应性喂养1周后，模型组和治疗组按7.5 mg/kg体重的剂量，一次性尾静脉注射ADR溶液（ADR溶液用无菌生理盐水配制浓度为2 mg/mL，且无絮状物漂浮），建立阿霉素大鼠肾病动物模型；对照组注射与阿霉素溶液等量的生理盐水。

1.2.2 给药

治疗组在建立阿霉素肾病模型前两天开始，每天给予1,25(OH)2D3灌胃，剂量为 0.25 μg/kg，对照组和模型组每天给予等量的花生油灌胃。治疗过程中大鼠自由饮食。

1.2.3 体重、血、尿检测

检测各组大鼠每周体重变化。分别于注射ADR溶液后第 2、4、6、8、10周处死大鼠，每组各 6只。处死前一天留取24 h尿液，进行24 h尿蛋白定量检验；腹主动脉采血检测 TP、Alb、BUN、Cre、TC。10%水合氯醛腹腔注射麻醉（麻醉剂量：0.35 mL/100 g），剖开腹腔快速剥离双肾并去除肾被膜，同时测量肾重，计算肾脏系数。（肾脏系数=双肾重/体重）。

1.2.4 电镜

取肾皮质1mm，依次用2.5%戊二醛、1%锇酸固定后行电镜（transmission electron microscope,TEM）检查。观察足细胞形态变化。

1.2.5 免疫组化

4微米肾组织石蜡切片常规脱蜡脱水，枸橼酸缓冲液（pH6.0）高温进行抗原修复，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，滴加nephrin大鼠抗体(美国abcam，1∶100)4℃过夜，次日滴加增强酶标IgG并于37℃温箱孵育30 min，然后依次进行显色、复染、封片。组织切片光镜下观察，阳性表达部位显示棕黄色，每张片子随机选取5个不重叠视野（×400），应用医学图像分析软件ImageProPlus 6.0半定量分析法评估nephrin蛋白的表达，以高倍视野下阳性表达的平均光密度值(AOD)表示其相对含量。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 造模后大鼠体征观察

对照组大鼠体形丰满，体重平稳增加，被毛浓密有光泽，饮食及排便均正常。模型组大鼠消瘦，体重降低，蜷缩好卧，与对照组相比反应迟钝、精神萎靡不振，被毛粗糙无光易脱落，进食量和排便量减少。与模型组比较，治疗组大鼠精神状态、反应及毛色均明显改善。

2.2 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠体重的影响

初始体重都在250 g左右，随着培养周数的增加，对照组从250 g增加到450 g，模型组生长缓慢，体重增加的最少，而治疗组开始体重增加的也相对缓慢，到5周以后基本与对照组增重速度相同（图 1）。

2.3 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠肾脏系数的影响

模型组大鼠各时间点肾脏系数与对照组同一时期相比均有所升高（P＜0.05）。与模型组比较，治疗组大鼠同时间肾脏系数下降（P＜0.05）（图2）。

图1 各组大鼠体重变化Fig.1 Weight changes of rats in each group

图2 各组大鼠肾脏系数比较Fig.2 Comparison on kidney index of rats in each group

2.4 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠24 h UTP的影响

与对照组比较，模型组24 hUTP显著上升，并持续升高（P＜0.05），表明模型复制成功。经1,25-(OH)2D3治疗后，SD大鼠尿蛋白水平逐渐降低，治疗至第6周末时，大鼠24 h UTP水平与模型组比较，显著下降（P＜0.05），至第 10周末时，24 h UTP水平降低至接近正常水平。（图3）。

图3 各组大鼠24 h尿蛋白定量比较Fig.3 Comparison on 24h urine total protein of rats in each group

2.5 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠血生化影响

第10周末各组大鼠生化指标：与对照组相比，模型组大鼠同一时期Cre、BUN、TC含量显著升高（P＜0.05），TP、Alb显著降低（P＜0.05）。与模型组相比，治疗组大鼠同一时期Cre、BUN、TC含量显著下降（P＜0.05），TP、Alb含量显著上升（P＜0.05），治疗至第 10周末时，SD大鼠血清 Cre、TC、TP、Alb恢复接近至正常水平，血清BUN明显降低，但仍明显高于对照组（表1）。

表1 10周末各组大鼠血生化指标比较Tab.1 Comparision on blood biochemical indexes of rats in each group at the end of 10 weeks

2.6 电镜观察1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠肾组织病理学影响

对照组大鼠肾外观呈红褐色，触之平滑柔软。模型组大鼠肾外观呈苍白色，被膜紧张；与模型组比较，治疗组大鼠上述病理学改变均有好转，质地红润，水肿程度减轻。

大鼠肾组织透射电镜观察结果显示，对照组大鼠足细胞形态结构正常，基底膜平滑均匀无增厚，足突结构清晰完整。模型组大鼠足细胞变扁平，基底膜出现增厚，足突广泛融合，胞质内微丝聚集成斑块状；部分区域可见足突从基底膜脱落，足细胞数减少、甚至消失。与模型组比较，治疗组上述病变有不同程度减轻，可见足细胞数恢复，足突融合轻微，基底膜无明显增厚（图4）。

图4 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠肾组织超微结构改变影响（TEM,×4000）Fig.4 Effect of 1,25-(OH)2D3on ultrastructural changes in kidney tissue of rats with adriamycin-induced nephropathy

2.7 1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin蛋白表达的影响

免疫组织化学染色显示，nephrin阳性物质镜下呈棕黄色颗粒，主要表达于细胞肾小球足细胞膜。对照组大鼠肾小球可见nephrin蛋白表达量高，在毛细血管襻中呈现连续、粗线样的分布。模型组仅少量nephrin蛋白表达，黄色沉积逐渐变淡、消失。治疗组较模型组有所改善，第10周末治疗组阳性表达率明显高于模型组（P＜0.05），肾小球中黄色沉积逐渐增加，至淡黄色或黄褐色连续粗线样分布（图5）。

图5 第10周末1,25-(OH)2D3对阿霉素肾病大鼠肾组织nephrin蛋白表达影响（IHC，×400）Fig.5 Effect of 1,25(OH)2D3on expression of nephrin protein of rats with adriamycin-induced nephropathy at the end of 10 weeks(IHC,×400)

3 讨论

慢性肾脏病是指由糖尿病肾病，系统性红斑狼疮，淀粉样变，癌症和药物等多种致病因素引起的肾脏结构和功能异常[10-11]。本研究利用以肾小球损伤为主的阿霉素肾病大鼠模型，其制备方法简单易操控。结果显示，大鼠给予阿霉素干预2周后，与对照组相比血清中肌酐、尿素氮、胆固醇含量均明显增加，血清白蛋白、总蛋白降低,（P＜0.05），表明模型构建成功[12]。

足细胞是肾脏肾小球高度特化的树状上皮细胞，临近波曼氏囊，包裹着毛细血管。当涉及到肾小球滤过时，足细胞通过提供包括相互交错的足突，以及足突之间的裂隙隔膜在内的过滤屏障，在血浆蛋白进入尿超滤液时发挥着重要作用[13]。肾小球滤过障碍是终末期肾功能衰竭的主要原因，在HFD/STZ诱导的糖尿病肾病模型中，小鼠出现明显的蛋白尿和肾小球损伤[14]。最近的研究发现，足细胞损伤可作为糖尿病肾病早期的重要病理特征[15]。nephrin特异性表达于肾小球足细胞裂隙隔膜，在维持肾小球正常发育和功能方面发挥着重要作用，其表达的降低是导致足细胞损伤的重要原因[16]，敲除成年小鼠的nephrin基因，加重了单侧肾切除术和阿霉素诱导的肾病的进展[17]。本研究发现，ADR诱导大鼠自第2周至实验结束10周时较对照组相比蛋白尿水平逐渐增加，肾组织nephrin蛋白的表达含量也明显下调；电镜结果显示ADR大鼠足细胞突起生长抑制，发生融合甚至脱落，基底膜出现不同程度的增厚，与文献报道一致。由此可知，足细胞损伤特别是足细胞标记蛋白分子nephrin的丢失，与ADR大鼠足细胞损伤以及蛋白尿的形成密切相关。

研究表明维生素D3及其类似物可以显著降低CKD患者包括糖尿病肾病患者的蛋白尿[18-19]。最近的一项研究结果提示在急性肾损伤患者中活性维生素D3的缺乏是患者预后的独立危险因素[20]。在多种动物模型包括5/6肾大部切除、STZ以及高糖诱导的肾病模型中发现给予维生素D类似物可以明显降低蛋白尿，减轻肾小球足细胞损伤[21-23]。与以往文献报道一致，本研究同样也发现维生素D3具有降低ADR大鼠尿蛋白水平的作用，并且能够减轻ADR大鼠足细胞足突融合脱落以及基底膜增生，表明其通过维持并恢复分化的足细胞表型来发挥其重要作用。免疫组化结果进一步发现，维生素D3逆转了足细胞nephein蛋白表达的下降。这些结果表明维生素D3能够促进ADR大鼠足细胞损伤修复，但其具体作用机制仍需深入探讨。

由此可见，肾小球足细胞受损导致出现蛋白尿是阿霉素肾病早期的典型病理、临床特征。活性维生素D3能够增加阿霉素肾病模型大鼠的体重、改善生存状态；使nephrin蛋白表达恢复接近正常水平，从而降低蛋白尿水平，对阿霉素肾病模型大鼠肾功能损伤有修复作用；对构成肾小球滤过屏障的足细胞有促进恢复的作用。该结果提示足细胞是活性维生素D3发挥肾脏保护作用的重要靶细胞，并且可能是通过上调nephrin蛋白的表达，来修复足细胞的损伤以及防止足细胞数目的减少，了解其涉及的分子水平机制将有助于活性维生素D3在慢性肾病治疗中的应用。