GDF11和维生素D对UMR106成骨样细胞增殖的影响

钱欢，凌君曼，曾莹莹，曾欣，李兴琳，呼海燕*

（成都医学院基础医学院，四川 成都，610500）

骨质疏松症作为常见的老年性疾病，目前已成为全球主要公共卫生问题之一[1]。骨质疏松症的发生与骨代谢有着密切联系。骨代谢主要是由破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成[2]，在多种代谢通路调节下共同维持骨的正常形态及功能。生长分化因子 11（growth difference factor11，GDF11）属于生长转化因子-β超家族成员，能够调节多个系统和器官如肾脏、神经系统和骨骼系统等的发育[3]，也是胚胎中轴骨发育的重要调节因子[4]，有文献[5]报道GDF11通过抑制PPAR-γ活性促使其蛋白泛素化(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰，从而改变骨骼脆性，认为补充GDF11可以治疗老年性骨质疏松症。维生素D是维持机体健康的重要营养物质，它的活性形式为1,25(OH)2D3，在骨骼发育上起到至关重要的作用[6]，主要通过1,25(OH)2D3/VDR信号[7]及OPG/RANKL系统[8]来调节成骨细胞分化，但也有学者提出BMP-2/Smads/Runx2[9-10]也是其调节途径之一。目前研究显示维生素D联合补充钙也具有预防骨质疏松的作用[11]。

虽然已知GDF11和维生素D都有治疗骨质疏松症的作用，但目前并未有GDF11和维生素D共同作用的相关实验研究报道。为此，本研究采用体外培养UMR106成骨样细胞，探讨GDF11和维生素D共同对细胞增殖以及Runx2、Osterix基因表达的影响，为骨质疏松症临床干预治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与分组

主要试剂：维生素D（总脱钙化固醇），由四川大学魏大鹏惠赠；GDF11购自R＆D systems。

实验分组：Group1：control；Group2:50 ng/mL GDF11;Group3:100 ng/mLGDF11；Group4：维生素 D；Group5：50 ng/mLGDF11+ 维生素 D；Group6：100 ng/mLGDF11+维生素D。

1.2 细胞培养

将UMR106细胞(大鼠骨肉瘤细胞株，四川大学华西口腔医学院陈雨雪教授惠赠)接种于含10%新生牛血清（四季青公司）、2%双抗（Billab公司）的DMEM高糖培养液（Gibco公司）中，置于37℃、5%CO2的恒温培养箱（上海一恒科技公司）内培养，细胞贴壁后每2 d换液1次，待细胞融合至80%～90%时使用0.25%胰蛋白酶（Sigma公司）消化，按1:2传代。

1.3 MTT法检测细胞增殖能力

将处于对数生长期的UMR106细胞消化并计数后，按5×103/孔的浓度接种于96孔板，每孔200 μL，置培养箱培养24 h，每组设8个复孔。每孔加入含药物培养液 200 μL，继续培养 24、48、72 h后，按MTT（Sigma公司）试剂说明进行操作，使用酶标仪（Bio-Rad公司）在490 nm处测吸光度（OD）值。

1.4 细胞ALP活性检测

将处于对数生长期的细胞按2×104/孔的浓度接种于24孔板中，每孔1 mL，每组5个复孔。加药分别培养24、48和72 h后，按ALP试剂盒（碧云天科技公司）操作步骤检测ALP活性：加入0.2%的Triton x-100裂解，离心取上清，取50 μL上清液加入50 μL显色底物，37℃孵育10 min，加入100 μL反应终止液终止反应，在405 nm处测OD值。使用标准品绘制标准曲线，计算碱性磷酸酶活性。

1.5 RT-PCR检测细胞Runx2 mRNA和Osterix mRNA的表达

将处于对数生长期的细胞按5×104/孔的浓度接种于6孔板中，每孔2 mL，每组4个复孔。加药分别培养24、48和72 h后，提取总RNA。按反转录试剂盒操（Takara公司）作步骤将总RNA反转录为cDNA，采用 SYBR green 染料（Takara公司）法，实时荧光定量PCR（qRT-PCR，Bio-Rad公司）检测各组细胞 Runx2及 Osterix的 mRNA表达，β-actin作为内参。反应体系为20μl，反应条件：95℃，3 min反应一个循环，95℃ 15 s，55℃ 15 s，共反应40个循环,65℃ 5 s。引物序列如下：Runx2的正向引 物 序 列 为 ：5’-CCGTGTCAGCAAAACTTCTT-3’，反向引物序列为：5’-CTCACGTCGCTCATCTTGC-3’；Osterix的正向引物序列为：5’-GGACAGCCAACCCTAGCC-3’，反向引物序列为：5’-TGGAGCCACCAAACTTGC-3’；β-actin 的 正 向 引 物 序 列 为 ：5’-CCCGCGAGTACAACCTTCT-3’，反向引物序列为：5’-CGTCATCCATGGCGAACT-3’，引物由成都擎科生物公司合成。反应结束后，使用溶解曲线判断特异性，将各样本的Ct值与β-actin内参基因做对照，基因相对表达量采用2－△△Ct法计算。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 细胞形态和数目

UMR106细胞是大鼠成骨肉瘤细胞系细胞，既具有成骨细胞的典型形态，也具有成骨细胞的生化功能[12]，其活性水平较原代培养的大鼠颅骨成骨细胞高，细胞增殖周期约为20 h。

细胞培养48 h后，显微镜下观察，见大量细胞贴壁，呈铺展生长状态，细胞多呈梭形、纺锤形。加药培养24 h后，成骨细胞典型形态愈发明显，且细胞数量明显增多，呈集落生长趋势（图1）。

图1 各组细胞形态和相对数量Fig.1 Cell morphology and relative quantity in each group

2.2 GDF11和维生素D对细胞增殖的影响

GDF11和维生素D对细胞增殖的影响见图2。

图2 GDF11和维生素D对细胞增殖的影响Fig.2 The effects of GDF11 and Vitamin D on cell proliferation

如图2A所示，细胞培养24 h后，与Control比，各组细胞增殖更为显著（P＜0.05）；与 Group2相比，Group5细胞增殖明显增多（P＜0.01）；与 Group3相比，Group6细胞增殖减少明显（P＜0.01）；Group4细胞增殖较 Group2、6细胞增殖更为显著（P＜0.05）。培养48 h（图 2B）后，与 Control相比，Group2、3、5 细胞增殖明显增多（P＜0.05），Group4、6细胞增殖无明显差异；与Group2相比，Group5细胞增殖亦明显减少（P＜0.01）；与 Group3相比，Group6细胞增殖明显减少（P＜0.01）；与 Group4 相比，Group3、5 细胞增殖明显增多（P＜0.01）。培养 72 h（图 2C）后，与 Control相比，Group2、3、5 及 6 细胞增殖显著 （P＜0.05），与Group2相比，Group5细胞增殖亦明显减少（P＜0.01），Group4细胞增殖无明显差异；与Group3相比，Group6细胞增殖明显减少（P＜0.05）；与 Group4相比，其他各实验组细胞增殖明显（P＜0.01）。

2.3 GDF11和维生素D对细胞ALP活性的影响

GDF11和维生素D对细胞ALP活性的影响见图3。

图3 GDF11和维生素D对细胞ALP活性的影响Fig.3 The effect of GDF11 and vitamin D on the activity of ALP in cultured cells

如图3所示，与Control相比，Group4在细胞培养 24、48和 72h后 ALP活性均无显著差异。Group2、3、5、6 ALP活性明显提高（P＜0.05）。 与Group4相比，Group2、3、5、6 仅在 24、48 h ALP 活性提高有显著差异（P＜0.05）。

2.4 GDF11和维生素 D对细胞 Runx2、Osterix mRNA表达的影响

GDF11和维生素D对细胞Runx2、Osterix mRNA表达的影响见图4。

图4 GDF11和维生素D对培养细胞Runx2、Osterix mRNA表达的影响Fig.4 Effects of GDF11 and vitamin D on the expression of Runx2 mRNA and Osterix mRNA in cultured cells

如图4A所示，培养24 h后，与对照组相比，Group2、3及5细胞Runx2 mRNA表达量显著提高（P＜0.05），Group4、6细胞 Runx2 mRNA 表达量无明显差异。培养48 h后，与对照组相比，Group2、3及6细 胞 Runx2mRNA 表达量提高显著（P＜0.05），Group4、5细胞Runx2 mRNA表达量无明显差异；与Group3相比，Group 6细胞 Runx2 mRNA表达量明显减少（P＜0.01）。培养 72 h后，与对照组比，Group2、3及6细胞Runx2 mRNA表达量提高显著（P＜0.05），Group4、5表达量无明显差异。

如图4B所示，培养 24 h后，与 Control比，Group2、3及6细胞Osterix mRNA表达量提高显著（P＜0.05），Group4、5细胞 Osterix mRNA 表达量无明显差异；与Group2比较，Group5细胞Osterix mRNA表达量减少显著（P＜0.05）。培养48 h后，与Control比，Group2、3及6细胞Osterix mRNA表达量提高显著（P＜0.05），Group4、5 细胞 Osterix mRNA 表达量无显著差异。培养72 h后，与Control比，其他各组细胞Osterix mRNA表达量改变均无明显差异。

3 讨论

骨质疏松症目前已位世界常见病、多发病的第7位，是一种年龄相关的慢性疾病，其发生的主要病理机制是成骨细胞的增殖与分化受到抑制，最终导致骨量减少和骨质疏松。因此提高成骨细胞的增殖和分化是预防和治疗骨质疏松症的关键。成骨细胞主要来源于多能干细胞-骨髓间充质干细胞。当细胞高表达 Runx2和Osterix时，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。Runx2是一种能够调控许多成骨相关基因（如Osterix等）转录的成骨分化特异性转录因子，可促进成骨细胞的成熟和胞外基质的分泌[13]。而Osterix是目前发现的最直接的调控骨形成的转录因子，位于Runx2的下游，它的缺失可直接使成骨细胞完全丧失骨形成能力[14]。

GDF11是近年来研究的热点抗衰老因子，与骨代谢有着密切联系。Sinha等[5]研究表明，骨质疏松症患者血浆和骨髓中的GDF11水平明显降低，补充可以增强肌肉的结构和功能。然而Weiqing Lin[15]团队则认为GDF11抑制成骨细胞分化，从而减少了骨量。我们前期实验研究发现，GDF11（50、100 ng/ml）对UMR106成骨样细胞增殖有促进作用（文章已投），说明GDF11和成骨细胞的增殖有着密切的联系。我们的实验结果表明，GDF11可通过提高Runx2、Osterix mRNA表达来促进成骨样细胞增殖和提高细胞内ALP活性，与前期实验结果一致。

维生素D是体内重要的维持钙、磷代谢稳定的一种类固醇激素，其活性代谢产物是1α,25(OH)2D3。目前研究表明大鼠服用活性维生素D3可以增加成骨细胞的数量，并提示可能与成骨细胞内存在维生素D受体有关[16]。资料显示维生素D通过OPG/RANKL信号通路对骨代谢起调节作用，维生素D促进成骨细胞的增殖[17]，增殖的成骨细胞通过Runx2信号通路分泌骨保护蛋白（osteprotegerin,OPG）和破骨细胞分化因子（osteoclast differentiation factor,ODF），二者共同调节破骨细胞的形成[18]，最终使成骨活动和破骨活动达到动态平衡，维持骨的正常形态和功能，实现骨重建。我们的研究结果显示，维生素D在短时间（24 h）内促进细胞增殖，但 ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表达增加不明显，这可能与维生素D对成骨细胞的影响与细胞的成熟程度有关[19]，同时，提示维生素D对成骨细胞增殖的促进作用可能并非通过Runx2信号通路实现，与文献报道一致。但另有结果提示维生素D抑制其增殖[20]。

我们的研究结果显示，维生素D与低浓度GDF11联合应用对细胞增殖具有协同效应，而与高浓度GDF11应用，则表现为拮抗效应。GDF11均能增加ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表达，但与维生素D联合应用后，ALP活性、Runx2 mRNA和Osterix mRNA表达明显低于GDF11，可能是GDF11和维生素D对成骨细胞增殖的信号通路不同，且两个信号通路之间相互影响，导致Runx2 mRNA和Osterix mRNA表达减少，但具体机制尚不明确。

综上所述，GDF11可提高 Runx2、Osterix mRNA的表达，促进细胞的增殖及提高ALP活性；维生素D促进细胞增殖，可能并非通过Runx2信号通路发挥作用；维生素D影响了GDF11促进细胞增殖的作用。