雷公藤红素对Hela细胞增殖和凋亡的影响

柯长洪，李家玉，蔡继业

（1.广东创新设计研究院，广东 佛山 528311；2.澳门科技大学，澳门 999078）

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一，近年来呈上升的趋势且趋于年轻化，严重影响了女性的健康。目前对肿瘤的治疗手段主要有手术切除、放疗、化疗等手段。但由于手术切除容易对身体造成伤害，只适合小部分病变且转移性较低的肿瘤患者；宫颈癌患者放疗后局部控制率低和远处转移率高，严重影响肿瘤的治愈率；虽然近年来化疗的基础与临床研究迅速发展，化疗药物在宫颈癌综合治疗中的作用倍受关注，但是化疗药物对身体的毒副作用不可忽视［1-2］。因此寻求新的、疗效高的对身体毒副作用小的化疗药物显得尤为重要。有充足的证据说明炎症的发生是肿瘤形成的一个关键因素，很多肿瘤都是源自感染炎症或是长期的处于炎症期，最后导致癌症的发生。流行病学以及临床研究也表明长期处于炎症也可能是各种慢性疾病的共病［3］。因此，能够抑制各种与炎症有关的标志分子的药物有助于癌症的预防。

雷公藤红素又名南蛇藤素是一种醌甲基三萜，来源于卫矛科雷公藤属及南蛇藤植物中，具有多种生物活性。用于治疗慢性炎症、风湿性疾病、系统性红斑狼疮、自身免疫性疾病等［4-6］。近年来研究表明雷公藤红素通过调节多种靶向分子，如TNF-a，NF-kB，COX-2，VEGF，Akt，CXCR4［7-8］；通过调节细胞内的信号通路，如AKT/mTOR，MAPK/JNK［9-11］；通过上调细胞表面的受体，如DR4、DR5，以及产生ROS［12］等途径来诱导肿瘤细胞的凋亡［13-17］。雷公藤红素一旦获准入市，它将成为继紫杉醇之后又一高效低毒的抗肿瘤植物药。

细胞凋亡途径一般分为两种，一种是细胞外部途径即细胞膜表面的死亡受体途径；另外一种是细胞内部途径即线粒体途径［18］。众所周知，线粒体膜电位的转换与细胞凋亡有着密切的关系。一旦线粒体通透性孔打开，有些分子诸如Ca2+就会大量涌入线粒体引起线粒体膜电位下降，从而引起促凋亡因子的激活，释放细胞色素C以及caspase蛋白家族激活，诱导细胞发生凋亡；而线粒体通透性孔的开放与ROS、以及Ca2+有着紧密的关系［19-20］。本研究主要从雷公藤红素诱导HeLa细胞产生ROS和线粒体这条途径探讨凋亡的相关机理，研究中药更好地杀伤癌细胞且对正常细胞伤害小提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人子宫颈癌HeLa细胞：贴壁细胞，由暨南大学生理研究室提供；雷公藤红素（＞98%），广州市齐云生物技术有限公司；CCK-8试剂盒，日本同仁化学研究所；二甲基亚砜、4%多聚甲醛、Ttiton X-100，美国Sigma公司；胎牛血清、DMEM高糖培养基，牛血清白蛋白（BSA），Gibco公司；细胞周期检测试剂盒，南京凯基生物技术发展有限公司；DAPI，美国 Sigma公司；Rhodamine-phalloidin，美国Biotium股份有限公司；培养板，美国康宁公司；实验用水，三蒸水。

MilliQ Academic 超纯水仪，美国Millipore 公司；CP Research 型原子力显微镜，Thermo microscopes 公司；高速多通道连续波长酶标仪，奥地利TECAN Safire2；510 Meta 激光共聚焦显微镜，德国Carl Zeiss公司；FACSCalibur 流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司。

1.2 细胞培养

用含10 %胎牛血清RPMI 1640培养基培养人子宫颈癌HeLa细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，2 mL接种于培养瓶中，置5% CO2、37 ℃培养箱内培养，一般以2～3 d 1：3传代一次，取对数期细胞用于实验。雷公藤红素被DMSO溶解为5 mg/mL的储存液，超声混匀，然后用培养基稀释成最终浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/mL的药物浓度组，DMSO的体积浓度小于0.1%。

1.3 CCK-8检测细胞存活率

在37 ℃、5% CO2的条件下，将人Hela细胞以5 000个/孔的密度接种于96孔板中进行培养，每孔100 μL。设0.5、1、1.5、2、2.5 μg/mL的实验组和一个空白对照，每组三个复孔。在细胞培养箱中孵育24 h后，吸去旧的培养基，每孔加入10 μLCCK-8溶液与100 μL新鲜培养基，在培养箱孵育2 h。摇匀后放于450 nm波长下用酶标仪测定各孔的OD值。根据公式（测量值-空白组/对照组-空白孔）×100%测得细胞存活率。

1.4 Annexin V/PI 检测细胞凋亡

与细胞增殖实验方法一样，雷公藤红素作用细胞24 h后，收集细胞与1.5 mL的EP管中，PBS缓冲液清洗细胞后，加入500 μL的buffer缓冲液轻轻吹打均匀后再依次加入5 μL的Annexin V-FITC，5 μL的PI染色液，继续轻轻吹打均匀，避光孵育15～20 min即可上机检测。

1.5 细胞周期检测

在37℃、5% CO2条件下，将人HeLa细胞以5×105个/孔的密度接种于6孔板中培养，每孔加入2 mL培养基过夜培养后，换掉培养基，重新每孔加入 2 mL终浓度为 0.5、1、1.5、2、2.5 μg/mL雷公藤红素孵育24 h后，收集细胞于EP管中，放在1 000 rpm/min转速下离心3～5 min，弃去上层液体，留下底层沉淀，再加入1 mL的PBS清洗2遍后弃去PBS，加入1 mL的75%的酒精于4 ℃下过夜。再次离心沉淀细胞，弃去酒精；PBS重悬细胞，洗涤离心弃去PBS。每管样品中加入0.5 mL的缓冲液，吹打均匀后，加入25 μL的PI染色液和10 μL的RNaseA，再次吹打均匀37 ℃下避光孵育30 min，流式检测。

1.6 细胞内活性氧（ROS）检测

对细胞内产生的活性氧进行检测是利用本身没有荧光的探针DCFH-DA，当它进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解成DCFH，而DCFH却不能透过细胞膜。细胞内产生的ROS将无荧光的DCFH氧化生成有荧光的DCF，从而对细胞内产生的ROS进行定量的检测。收集细胞PBS清洗后，加入10 μM的DCFH-DA避光染色30 min后，用无血清的1640培养基清洗干净，最后用200 μL的1640无血清培养基重悬细胞即可上机检测。

1.7 线粒体膜电位检测

罗丹明123（Rhdamine 123，Rh123）是一种可透过细胞膜的阳离子荧光探针，在正常细胞中能够依赖线粒体的跨膜电位进入线粒体基质，特异性的标记线粒体；在细胞凋亡发生时，线粒体膜完整性遭到破坏，引起线粒体跨膜电位的崩溃，Rh123重新释放出线粒体，用蓝光激发时，发出绿色荧光。通过荧光信号的强弱即可检测线粒体膜电位的变化和凋亡的发生。经过雷公藤红素作用细胞24 h后，离心收集细胞于1.5 mL的EP管中，PBS清洗细胞2～3遍后，加入2 μM的的罗丹明123染色液室温避光孵育30 min后，上机检测。

1.8 细胞内钙离子水平检测

Fluo-3AM是检测细胞内自由钙离子的常用荧光探针，它可以穿透细胞膜，本身荧光很弱，且不会随着钙离子浓度的增大而上升。进入细胞后，被细胞内的酯酶剪切成Fluo-3从而被滞留在细胞内。Fluo-3在没有同钙离子结合的情况下，无荧光产生；然而在与钙离子结合后，其荧光强度可增加40倍以上。基于Fluo-3AM的指示原理，分别用500 μL的Fluo-3AM （5 μM）对雷公藤红素处理组进行染色荧光标记，30 min后用流式细胞仪进行荧光强度检测。

1.9 共聚焦显微镜对Hela细胞骨架和细胞核检测

不同浓度雷公藤红素（0、1、2 μg/mL）处理细胞24 h后，吸去培养基，用PBS在摇床上清洗细胞3次。然后用2.5 %的戊二醛固定细胞15 min，置于摇床上用PBS清洗细胞三次。除去上清液后，用0.5 %的TritonX-100和含0.1 %BSA的PBS溶液处理细胞15 min，然后每片加入200 μL终浓度为200 nM罗丹明-鬼笔环肽试剂在37 ℃恒温水浴中孵育30 min。去除多余未反应的罗丹明-鬼笔环肽，用PBS漂洗样品三次，然后封片。样品制备好后立即于激光共聚焦显微镜下观察。（共聚焦显微镜的型号为Carl Zeiss LSM510 Meta Duo，63 x 1.4 油浸式物镜，Ag /Kr激光器，488 nm 激光激发，红色荧光采用BP560-615探测。）

不同浓度雷公藤红素（0、1、2 μg/mL）处理细胞24 h后，将生长有HeLa细胞的盖玻片用PBS在摇床上清洗三遍（每次3～5 min），往盖玻片上滴加4 %的多聚甲醛室温下固定15 min，然后继续用PBS在摇床上清洗三遍（每次3～5 min）；在盖玻片上加入100 μL的0.1 μg/mL DAPI染色液，室温下孵育15 min。PBS缓冲液洗涤细胞三遍后，用甘油封片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.10 AFM对细胞形貌和超微结构进行检测

不同浓度雷公藤红素处理细胞24 h后，取出附有细胞的玻片，用PBS缓冲液清洗，然后用4%的多聚甲醛固定细胞15 min，用蒸馏水冲洗3次，室温自然晾干；将制备好的样品置于原子力显微镜（atomic force microscope，AFM）（Autoprobe CP Research，Thermomicroscopes）的XY扫描台上，用监视器定位所要扫描的样品区域，在空气中室温下应用AFM对样品进行扫描成像。实验采用150 μm扫描器，接触模式成像，UL20B硅探针，微悬臂的弹性系数为2.8 N/m。扫描方向上出现的低频背景噪音用AFM图像自带软件（IP 2.1版）的平滑处理。

2 结果与讨论

2.1 CCK-8实验

检测药物对HeLa细胞凋亡的影响前，我们用CCK-8来检测了不同浓度的药物对细胞生长增殖的影响。实验结果表明，雷公藤公素能够显著的抑制HeLa细胞的增殖。浓度分别为0.5、1、1.5、2、2.5 μg/mL的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后，细胞的存活率从0.5 μg/mL的87.2%±4.3%下 降 到2.5 μg/mL的14.9%±2.6%。CCK-8结果表明细胞的存活率与雷公藤红素的作用时间呈剂量依赖关系，见图1。

/%×100率活存浓度/（μg/mL）

2.2 雷公藤红素诱导细胞凋亡

为了进一步证明雷公藤红素能够诱导HeLa细胞的凋亡，我们用流式细胞仪来检测药物作用前后细胞凋亡的变化。Q2表示晚期凋亡和死亡，Q4表示早期凋亡。随着雷公藤红素浓度的增大，早期凋亡和晚期凋亡均呈现递增趋势，但是早期凋亡明显占主导地位，也即雷公藤红素主要是诱导细胞以程序性的死亡为主，这与CCK-8得到的实验结果一致，见图2。

2.3 雷公藤红素阻滞Hela细胞于S期

CCK-8和凋亡数据表明雷公藤红素能明显抑制HeLa细胞的增殖，有文献表明很多抗癌药物通过扰乱或是阻止细胞有丝分裂，使细胞阻滞在G0/G1，S，G2/M 期，细胞周期受阻的程度取决于细胞当时所处的时期，若细胞不能修复DNA损伤，将进入凋亡程序［14-16］。不同浓度雷公藤红素作用细胞24 h后，对HeLa细胞的周期有明显的影响。与对照组比较，随着雷公藤红素浓度的增加，S期细胞比例随之上升，从28.9%±2.4%上升到最高浓度组的61.9%±2.9%，G0/G1期细胞随之明显减少，而G2/M 期细胞比例无明显变化，结果表明雷公藤红素能够阻滞Hela细胞于S期，见表1。

图2 0～2.5μg/mL的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后的细胞凋亡流式图

表1 0～2.5μg/mL雷公藤红素作用Hela细胞24 h后，对细胞周期影响

2.4 雷公藤红素诱导细胞ROS产生

肿瘤细胞生物化学性质最显著的变化就是细胞内活性氧的产生，大多数肿瘤细胞由于新陈代谢的增加以及活性氧的产生，处于一定的氧化应激。慢性、低水平的ROS能够促进细胞的分裂与细胞增殖，并且增加基因组的不稳定性从而导致肿瘤的发生和进展。虽然ROS对肿瘤的形成和发展起着重要作用，但是持续、高水平的ROS会诱导肿瘤细胞的氧化损伤。Trachootham等研究发现，肿瘤细胞内ROS的含量比正常细胞内的含量要高，且正常细胞对进一步增加的ROS抵抗能力明显要高于肿瘤细胞，这就提示利用抗癌药物增加细胞内ROS的产生有助于对肿瘤细胞的治疗［21］。为了研究雷公藤红素的生物活性，我们首先对雷公藤红素作用后HeLa细胞内的ROS水平进行检测。ROS定量的检测是通过流式细胞仪测定有荧光的DCF的荧光强度来间接测定的，DCF荧光强度值的大小即可反映细胞内ROS水平的变化情况。从图3可以发现随着雷公藤红素浓度的增大，DCF的荧光强度均呈现递增的趋势，说明细胞内产生的ROS也随着药物浓度的增大，产生的量也在增加；最高浓度2.5 μg/mL雷公藤红素产生的ROS是对照组的2倍左右。

图3 0～2.5 μg/mL雷公藤红素对HeLa细胞内ROS水平的影响

2.5 雷公藤红素诱导线粒体膜电位降低

有研究表明，线粒体通透性孔的转换对细胞的凋亡有着至关重要的作用，一旦线粒体通透性孔打开，小分子和离子就会流进线粒体，导致线粒体膜电位的改变。从而引起细胞色素C的释放以及激活caspase蛋白家族，最终诱导细胞的凋亡。然而Kowaltowski等［22］报道，线粒体通透性孔的开放并非自发的，而是在氧化应激和线粒体内钙离子超载的刺激下打开的。线粒体是细胞内ROS产生的主要来源场所，ROS产生与清除的不平衡就会导致线粒体氧化应激。线粒体通透性的转换与线粒体中蛋白巯基的氧化还原状态以及线粒体非蛋白成分的氧化损伤有关，一旦线粒体内膜巯基被氧化或是脂质氧化就会促进线粒体通透性的转换［23-26］。为了更深的了解雷公藤红素诱导HeLa细胞凋亡的机理，我们利用荧光染料罗丹明-123对HeLa细胞的线粒体膜电位进行定量的检测。通过罗丹明-123荧光强度的变化就可以清楚的掌握药物对细胞线粒体膜电位的影响。如图4所示，雷公藤红素作用细胞24 h后，流式细胞仪检测罗丹明-123的荧光强度随着药物浓度的递增逐渐减弱，最高浓度下降到了对照组的1/3，这就表明雷公藤红素通过产生活性氧使得细胞内的氧化还原平衡失调，从而使得线粒体膜电位发生变化。

图4 0～2.5μg/mL的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后，细胞内罗丹明-123的荧光强度

2.6 雷公藤红素诱导钙离子水平升高

Feissner等［27-29］指出，线粒体通过自身线粒体膜电位的下降大量摄取细胞质中的钙离子。因此，钙离子浓度的变法与细胞的凋亡也有着重要的关系。因此，对调节钙离子释放通道的研究有助于了解药物通过线粒体途径诱导细胞凋亡的相关机理。钙离子从内质网中释放出来主要由inositol 1，4，5-trisphosphate receptors （IP3 receptors） and ryanodine receptors这两种受体来介导。一旦他们被异常的活化，就会扰乱正常的钙离子信号通路而最终破坏线粒体膜电位。基于此，我们用荧光探针Fluo-3AM对细胞内自由钙离子浓度进行检测，通过Fluo-3的荧光强度来检测细胞内自由钙离子的浓度。如图5所示，雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后，细胞内Fluo-3的荧光强度均高于对照组1503，2.0 μg/mL时钙离子浓度上高了2.5倍左右。 有相关文献表明，ROS可以活化inositol 1，4，5-trisphosphate receptors （IP3 receptors） and ryanodine receptors这两种受体，从而增加细胞内钙离子浓度，我们的实验结果证明了这一观点。

图5 0～2.5 μg/mL的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后，细胞内Fluo-3的荧光强度

2.7 激光共聚焦显微镜对细胞F-肌动蛋白骨架和细胞核的观察

肿瘤的发生是一个多步骤的过程，涉及到各种信号通路的畸变，这将有利于转化细胞的转移。然而临床上关于肿瘤治疗最棘手的并非是原发性肿瘤（因为原发性肿瘤可以通过手术切除），而是肿瘤细胞的转移和扩散［30］。因此，对肿瘤细胞侵袭和转移机制的研究有助于临床上对转移性肿瘤的治疗。细胞的迁移包括肌动蛋白骨架重构、粘附、基底脱附、细胞牵张，其中，肌动蛋白骨架的解聚跟重排是细胞迁移的首要步骤［31-32］。在本实验中，我们利用罗丹明标记的鬼笔环肽来观察雷公藤红素对HeLa细胞F-肌动蛋白骨架的影响。

在LSCM下，我们可以观察到对照组细胞的骨架呈现丝状的有序排布，且其排列方向与细胞长轴方向平行伸展（图6A）。而1.0 μg/mL的雷公藤红素作用24 h后，丝状的骨架明显减少，且大多分布在细胞的边缘，细胞的中间出现颗粒状的肌动蛋白（图6B）；当药物浓度继续增大到2.0 μg/mL时，细胞边缘的丝状骨架消失，细胞形态也变圆，细胞的骨架变的模糊不清。据有关文献报道，Action在胞内主要以丝状的F-action和颗粒状的G-action两种状态存在，而前者是骨架的主要成分。LSCM图像表明，雷公藤红素使长纤维状的F-action解聚成颗粒状的G-action。这一特性的转变，HeLa细胞的运动能力将受到显著的抑制，这为治疗转移性肿瘤特别是高转移性肿瘤提供理论依据。

进一步佐证雷公藤红素对细胞的损伤，我们用DAPI对细胞核进行染色。DAPI是一种能够特异性与DNA结合的荧光染料，当与DNA结合后其荧光强度显著增强，借助激光共聚焦显微镜就可以对细胞核的形貌进行成像。细胞凋亡往往伴随着染色质的浓缩、断裂。本实验中，雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后，通过DAPI染色，激光共聚焦显微镜数据表明，对照组细胞的细胞核圆润且饱满，核质分布均匀（图6D）；经过1.0 μg/mL雷公藤红素作用后，细胞核的核质皱缩成月牙状，核质分布不均匀（图6E）；雷公藤红素浓度上升到2.0 μg/mL时，核质继续浓缩甚至大部分的细胞核出现断裂（图6F）。

图6 不同浓度的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后细胞骨架（A-C）和细胞核形态（D-F）

2.8 AFM对细胞形貌观察

细胞膜有重要的生理功能，它既能维持稳定代谢的胞内环境，又与外界坏境信息、物质、能量的交换息息相关，细胞的生理功能和状态又与细胞结构的变化有着千丝万缕的关系，因此对细胞形态及超微结构的研究意义重大［20］。原子力显微镜对不同浓度（1.0、2.0 μg/mL）药物处理前后细胞形貌进行成像，药物作用之后，细胞的形态发生明显的变化：图7（A，D）给出了未经药物处理的HeLa细胞的AFM形貌图，图7A、7D分别为为对照组的AFM拓扑图和3D图，从图中可以看到，细胞紧密生长且呈现长梭形状，说明细胞彼此间的信息和物质交流比较充分，细胞处于生长旺盛期，细胞膜完整。对其3D结构图感差可以明显见到中间凸起的细胞核，细胞核圆润且饱满（剪头所指出）；图7（B，E）和图7（C，F）为1.0、2.0 μg/mL雷公藤红素作用HeLa细胞24 h的AFM图，与对照组比较，我们可以发现随着药物浓度的增大细胞由长梭形状逐渐皱缩成椭圆形状，细胞膜也逐渐遭到破坏，细胞核逐渐皱缩；高浓度时甚至可见到细胞核部分裂解。这些形貌特征的改变说明雷公藤红素处理Hela细胞后，HeLa细胞的活性遭到破坏从而伴随着凋亡的发生。

图7 不同浓度的雷公藤红素作用HeLa细胞24 h后的原子力显微镜图

2.9 AFM对细胞超微结构观察

图8 AFM观察雷公藤红素对HeLa细胞形貌及其超微结构的影响

Wang Mu等［33］通过AFM研究发现，抗癌药物作用细胞后，由很多纳米粒子组成的细胞膜随着药物浓度增大，细胞膜粗糙度逐渐增大，细胞表面出现孔洞；细胞膜富含高度不饱和脂肪酸，极易受到ROS氧化损伤。雷公藤红素作用细胞24 h后，细胞膜表面发生显著变化：从图8D～8I 10 μm超微结构我们可以看到，对照组的细胞膜表面比较光滑（图8 D）；而随着药物浓度的增大，细胞膜表面逐渐变得凹凸不平，出现了明显的小孔（图8 E，8F）；对其10 μm的表面粒径统计分析表明，细胞表面的粒径分布从对照组的28.82 ± 4.87上升到1.0 μg/mL的 59.23 ± 3.65 以及 2.0 μg/mL 的 87.48 ± 6.85。紧接着我们又对细胞3 μm超微结构的均方根粗糙度（Rq）和平均粗糙度（Ra）进一步进行分析，随着药物浓度的增大两者呈现上升的趋势，这也进一步佐证了雷公藤红素通过破坏细胞膜的结构，引起细胞内线粒体膜电位以及钙离子水平的扰动从而诱导细胞凋亡。

3 结论

本研究结果表明：雷公藤红素在微小剂量水平即能抑制Hela细胞生长，诱导Hela细胞凋亡，雷公藤红素诱导的细胞凋亡主要是通过阻滞Hela细胞于S期，阻止细胞正常的有丝分裂从而抑制细胞的增殖。而细胞内ROS上升，线粒体膜电位下降以及从钙离子水平上升最终诱导Hela细胞的凋亡；细胞凋亡过程中形态学的变化通过共聚焦显微镜对其细胞核和骨架检测也得到了进一步验证，药物作用后，染色质皱缩和细胞核裂解；细胞骨架由对照组的有序丝状排布逐渐变得无序甚至消失而出现颗粒状。同时借助超高分辨率的AFM对雷公藤红素作用细胞24 h后超微结构进行了分析，对照细胞呈现长梭形，细胞彼此紧密联系，细胞生长状态旺盛，细胞膜表面光滑，细胞表面颗粒分布也比较均匀；而随着药物浓度的增大，细胞逐渐变圆，细胞膜逐渐遭到破坏，光滑的表面变得粗糙，甚至出现小的孔洞。这为在纳米尺度上研究抗癌药物与细胞之间的相互作用提供重要的理论依据。