姜黄提取物对小鼠肝纤维化的影响

2018-08-29肖志勇

生物技术通讯 2018年4期

肖志勇

福建拓天生物科技有限公司，福建福州 350000

肝纤维化是多种原因引起的慢性肝病演化为肝硬化的中间必经阶段。肝硬化是不可治愈的，而肝纤维化是可治愈的。肝纤维化若及时在早期发现并进行有效的治疗，可得到完全逆转而治愈。四氯化碳（CCl4）是一种常用于诱导构建肝纤维化模型的肝毒素，进入体内会导致血清中谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）与谷丙转氨酶（cereal third transaminase，ALT）的升高，引起肝损伤，长时间给予CCl4将会导致肝损伤转化为肝纤维化[1]。

姜黄（Curcuma longaL.）是姜科草本植物，是一种广泛种植于亚洲的传统药草[2]。姜黄中含有包括多酚铁结合姜黄素复合物和相关姜黄素的高含量的生物活性复合物[3-4]，具有很长的药用历史，在中国已有数百年用于治疗肝病的历史[5]。

目前，采用超声波提取法、研磨提取法及醇提取法等可获得具有生物活性的姜黄提取物。2016年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准多卡斯生物技术公司（DoCas Biotech）生产的姜黄提取物为食品中“安全使用物质（GRAS）”[6]。姜黄提取物主要成分为姜黄素、脱甲氧基姜黄素，双脱甲氧基姜黄素等。姜黄提取物有抗肿瘤、抗氧化、抗血脂、促纤溶作用、增强免疫力等功能[7-9]。

姜黄素是一种天然食用色素，亦是姜黄提取物中主要活性成分之一。姜黄素的药理作用广泛，包括抗肿瘤、抗炎、保肝等[1]。研究表明，姜黄素可抑制肝癌H22荷瘤小鼠的肿瘤生长，使CCl4所致肝损伤小鼠血清ALT的升高显著降低[10]；姜黄素能够通过显著抑制CCl4诱导的血清中AST、ALT的升高，增强肝细胞抵抗磷脂氧化的作用，保护生物膜的完整性[11]；姜黄素能减轻CCl4诱导大鼠发生的肝损伤与肝纤维化[12]。这说明姜黄素对肝脏有一定的保护作用。

我们通过建立CCl4诱导型肝纤维化小鼠模型，探究姜黄提取物对小鼠肝纤维化的影响，为开发治疗肝纤维化药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠，健康雄性，6周龄，体重18～22 g（南京大学-南京生物医药研究院）。

α肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）试剂盒（南京建成生物科技有限公司）；Masson三色染色液（北京索莱宝科技有限公司）。

1.2 姜黄提取物的制备

称取50 kg姜黄，重复榨汁2次，姜黄汁和姜黄渣待用；将姜黄汁于60～70℃浓缩至比重为1.1～1.4，获得姜黄汁浓缩液，待用；姜黄渣置于其重量6倍的75%乙醇中浸泡2 h后，加热至60～70℃回流提取2 h，获得以姜黄素等为主要成分的醇提液；醇提后的姜黄渣置于其重量6倍的蒸馏水中，加热至80℃提取2 h，获得以多糖为主要成分的水提液；将醇提液和水提液合并，加热至60～70℃，浓缩至比重为1.1～1.4，获得提取浓缩液；将姜黄汁浓缩液和提取浓缩液合并，加入浓缩液重量2%的糊精并搅拌均匀，降低浓缩液黏稠度；浓缩液进行喷雾干燥，即获得姜黄提取物。

1.3 肝纤维化小鼠模型的建立

C57BL/6雄性小鼠12只，随机分为正常组、模型组、姜黄素提取物给药组、姜黄素给药组，共4组，每组3只。除正常组外，其余各组腹腔注射20%CCl4-橄榄油溶液（5 mL/kg体重），1周注射2次，连续注射6周，建立小鼠肝纤维化模型。正常组予以相同剂量的橄榄油皮下注射，注射时间与其余组相同。

1.4 给药处理

姜黄提取物给药组和姜黄素给药组分别用溶于0.1%DMSO的姜黄素提取物和姜黄素进行灌胃（100 mg/kg体重），正常组和模型组小鼠用0.1%DMSO灌胃（100 mg/kg体重）。各组均每天灌胃1次，连续灌胃30 d。

1.5 血液采集及血清制备

给药灌胃实验结束后，各个小鼠分别称重，摘除眼球采集血液，离心后获得血清。

1.6 肝脏采集及处理

将小鼠脱颈，打开腹腔采集肝脏组织，称取重量。将肝脏组织分为2部分，一部分迅速置液氮中冷冻，-80℃保存；另一部分用4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片，用于HE及Masson染色分析。

1.7 小鼠血清生化指标检测

利用Ysmex-2100全自动血液分析仪（希森美康生物科技有限公司）检测小鼠血清中ALT、AST、TC、甘油三酯（triglyceride，TG）指标；采用酶联免疫吸附试验法（ELISA）测定血清中TNF-α及IL-6的水平。具体检测操作按相应试剂盒说明书进行。

1.8 小鼠肝脏生化指标检测

小鼠肝脏中TC、TG、SOD、MDA、GSH-Px指标的检测按照相应试剂盒说明书进行。

1.9 小鼠肝脏组织病理切片的HE染色和Masson染色

1.9.1 染色前处理取小鼠肝脏组织块放入10%福尔马林中固定，放入一系列浓度梯度的酒精和二甲苯中分别进行脱水和透明，在已溶解的石蜡中进行包埋，切片贴片，放入一系列浓度梯度的二甲苯中脱蜡，再经过一系列从高到低浓度梯度的酒精，最后放入蒸馏水中片刻，即可进行染色。

1.9.2 HE染色将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5 min；酸水及氨水中分色，各10 s；流水冲洗1 h后入蒸馏水片刻；放入70%和90%酒精中各10 min脱水；放入酒精伊红染色液中染色2 min；经无水乙醇脱水和二甲苯透明，滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固，即可用显微镜观察。

1.9.3 Masson染色根据Masson三色染色液的说明书对脱蜡至入水的切片进行Masson染色，染色封固后用显微镜观察。

1.10 数据统计

采用统计分析软件SPSS19.0分析单因素方差，数据均以x±SD表示，认为P＜0.05时差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄提取物对肝纤维化小鼠血清生化指标的影响

姜黄提取物对肝纤维化小鼠血清生化指标的影响如表1所示。与正常组相比较，模型组小鼠血清中的ALT、AST、TG、TNF-α和IL-6水平显著升高，而TC则显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组相比较，姜黄提取物及姜黄素给药组小鼠血清中的 ALT（P＜0.01）、AST（P＜0.01）、TNF-α（P＜0.05）、IL-6（P＜0.05）均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；姜黄素给药组的TG也显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05），而姜黄提取物给药组的TG无显著变化，但2组小鼠血清中的TC无显著变化；与姜黄素给药组相比，姜黄提取物给药组血清的各个指标均无显著变化。

2.2 姜黄提取物及姜黄素对肝纤维化小鼠肝脏生化指标的影响

结果见表2。与正常组相比较，模型组小鼠肝脏中的TC和SOD均显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）；TG、MDA和GSH-Px均无显著变化。与模型组相比，经姜黄素提取物及姜黄素给药组的小鼠肝脏中TG、TC、SOD、MDA和GSH-Px均无显著变化。

表1 姜黄提取物对小鼠血清生化指标的影响（x±SD）

2.3 姜黄提取物对小鼠肝脏组织病理的影响

用光学显微镜观察各组小鼠肝脏组织的病理形态，以确定姜黄提取物对小鼠肝脏组织病理的影响，结果如图1、2。正常组小鼠肝脏组织的汇管区、小叶、肝细胞的胆管未见异常，细胞排列界限清晰，无明显的胶原纤维沉积，未见纤维增生的现象发生。模型组小鼠肝脏组织的汇管区出现部分炎细胞浸润；小叶结构异常紊乱，不能分辨；肝脏组织有明显的胶原纤维沉积，肝细胞的胆管增生明显，细胞发生明显坏死。与模型组相比，姜黄提取物给药组小鼠肝脏汇管区的炎细胞浸润明显减少，肝细胞的胆管增生和肝组织胶原纤维含量明显减少。与姜黄素给药组相比，姜黄提取物给药组无显著差异。

3 讨论

纤维化在多种器官（大脑、肺脏、心血管系统、肾脏、胰腺等）中均可发生，持续发展将严重致死。肝脏具有生物转化作用，是机体内代谢及排毒的重要器官，因而也是用于研究纤维化的理想器官。迄今，大多关于纤维化的研究都是在动物肝脏中进行的。相较于检测肝纤维化的一般血清标志物［如层粘连蛋白（LN）、Ⅲ型前胶原（PCⅢ）、Ⅳ型胶原（Ⅳ-C）、ALT及AST等］，新型血清分子标志物（如非编码RNA、成纤维细胞因子、ECM相关标志物及分子组学等）能准确鉴别肝纤维化的程度，有助于更全面地分析肝纤维化病因[13]。

目前，治疗肝纤维化的药物疗效并不理想，安全有效的药物有待开发，此研究方向已受到国内外重视[14]。研究表明，中草药植物及从中提取的有效成分对肝纤维化具有治疗作用[15-16]。已有研究表明，采用灌胃方法进行姜黄提取物给药，对小鼠的精神神经系统、血压、呼吸及心电图的影响不明显[17]。2016年美国FDA已批准姜黄提取物为食品“安全使用物质”[6]，而姜黄素是姜黄提取物中的主要生物活性成分，说明姜黄提取物及姜黄素均是相对安全的药物。本实验研究了姜黄提取物对CCl4诱导小鼠肝纤维化的影响，结果证明姜黄提取物有改善肝纤维化的作用。实验结果表明，姜黄提取物及姜黄素给药的2组小鼠之间的指标及病理学形态无显著差异，即姜黄提取物与姜黄素两者的效果相当，说明在小鼠肝纤维化治疗恢复中，姜黄提取物的有效成分姜黄素起主要作用。相比于姜黄素的提取纯化操作复杂及高成本，姜黄提取物的制备操作简单，成本低，作为治疗肝纤维化的药物具有一定的优势。因此，本实验为开发新型低成本的安全、有效、理想的治疗肝纤维化药物奠定了基础。