利用小干扰RNA沉默长非编码RNA ZFAS1能够促进安罗替尼对非小细胞肺癌的抗肿瘤活性

王凤玲

陕西省军区西北一路干休所 卫生所，陕西 西安 710003

NOTCH蛋白及其信号通路是机体多项生理功能（如发育与细胞分裂等）的调节因子，同时也是肿瘤细胞发生与进展等的重要调控因子[1]。现已证实，NOTCH是恶性肿瘤细胞抗肿瘤治疗（放射治疗或药物治疗）耐受的首要调控枢纽，在非小细胞肺癌细胞中，NOTCH信号通路持续性激活，能够通过介导肿瘤细胞上皮间质转化等机制促进肿瘤细胞对射线、抗肿瘤药物等的耐受[2]。目前，非小细胞肺癌细胞中NOTCH信号通路活化的机制尚不完全清楚。

ZFAS1是恶性肿瘤中一类重要的长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA），能够促进非小细胞肺癌的增殖与侵袭作用[3]。据报道，ZFAS1与NOTCH通路的活化密切相关，是NOTCH通路在非小细胞肺癌中活化的可能机制之一[4]。ZFAS1能够促进NOTCH蛋白的活化，进而影响肿瘤细胞的增殖与进展等。因此，ZFAS1不仅是重要的恶性肿瘤发生与进展的指示分子，是NOTCH活化等的可能机制，也能够作为干预靶标，在恶性肿瘤细胞治疗中发挥重要作用。

为探索以ZFAS1为代表的lncRNA在非小细胞肺癌中的作用，我们将ZFAS1的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）表达载体转染非小细胞肺癌细胞系A549，再利用体内外（细胞与动物模型）研究模型，检测新型分子靶向药物安罗替尼（anlotinib）[5]对A549细胞的体外、体内杀伤作用，以及ZFAS1的siRNA对安罗替尼杀伤非小细胞肺癌是否具有增敏作用。

1 材料和方法

1.1 材料

裸鼠由北京维通利华公司提供；非小细胞肺癌细胞系A549由中国医学科学院/中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心提供；胎牛血清（FBS）、DMEM培养基购自Hyclone公司；细胞培养皿、96孔细胞培养板购自Corning；安罗替尼购自MCE公司（产品编号：HY-19716）；吸入麻醉剂乙醚为北京国药公司产品；细胞、组织总RNA提取试剂盒、定量PCR（qPCR）试剂盒为ABI公司产品；qPCR使用的引物由上海生工公司合成；定量PCR实验中，参照Xie等的文献设计引物序列[6]。

细胞培养与观察使用Nikon公司的相差倒置显微镜；定量PCR实验使用ABI公司的ABI-7500荧光实时定量仪。

1.2 细胞培养与肿瘤皮下模型

A549细胞用含10%FBS的DMEM于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞状态良好时稳定转染对照siRNA或ZFAS1 siRNA（siZFAS1），之后用系列浓度梯度的安罗替尼处理A549细胞，进行MTT检测，绘制药物杀伤A549细胞的量效关系曲线，计算药物作用的IC50值；收集细胞并将细胞注射于裸鼠皮下（每只动物注射约5×106细胞）。根据细胞与药物治疗情况，进一步将裸鼠分为4组，分别为对照组、siZFAS1组、安罗替尼组（对照+安罗替尼）及siZFAS1+安罗替尼组。具体来讲，A549细胞分别转染对照siRNA或siZFAS1，再分别灌胃给予生理盐水（溶剂对照）或1 mg/kg安罗替尼，每日灌胃给予药物1次，连续治疗2～3周后收集动物，按照Jia等[7]与Feng等[8]的方法测量肿瘤组织体积，并对肿瘤组织进行称量以获得肿瘤重量数据。

1.3 定量PCR

收集并获得皮下肿瘤组织，按照试剂盒说明书进行实验，提取组织中总RNA样本、反转录并进行定量PCR实验，检测各组肿瘤组织中上皮-间质转化标志分子E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白及波形蛋白等的表达[9]。

1.4 非小细胞肺癌肝转移

A549细胞稳定转染表达载体后，通过肝门静脉注射入裸鼠肝脏（1×105细胞），再分别灌胃给予生理盐水或1 mg/kg的安罗替尼，每日治疗1次，连续治疗2周后收集动物并获得肝脏，拍照，用图形分析软件计算病灶（多发与弥散的肿瘤组织）占肝脏的比例。

1.5 统计学分析

使用SPSS17.0软件，采用单因素方差分析比较x±s方法计算P值。

2 结果

2.1 siZFAS1能够促进安罗替尼对A549细胞的杀伤作用

首先检测了系列浓度梯度的安罗替尼对A549细胞的杀伤作用，结果如图1，安罗替尼能够剂量依赖地杀伤A549细胞，抑制A549的存活。转染siZFAS1可显著促进安罗替尼对A549细胞的杀伤作用，与对照siRNA相比，siZFAS1组安罗替尼作用于A549细胞的IC50值从0.50±0.04 μmol/L下调为0.14±0.01 μmol/L。

图1 siZFAS1能够促进安罗替尼对A549细胞的杀伤作用*P＜0.05

2.2 siZFAS1能够促进安罗替尼对A549细胞皮下成瘤的抑制作用

在前述基础上，检测了安罗替尼对A549细胞的杀伤作用，结果如图2，转染siZFAS1能够显著促进安罗替尼对A549细胞皮下成瘤作用的抑制活性。

图2 转染siZFAS1能够促进安罗替尼抑制A549皮下成瘤作用

2.3 siZFAS1能够促进安罗替尼对A549细胞肝转移的抑制作用

在此基础上，将A549通过肝门静脉接种裸鼠肝脏，可在肝脏中形成多发与弥散的病灶。安罗替尼能够抑制A549细胞的肝转移作用，而转染siZFAS1能够促进安罗替尼对A549细胞肝转移的抑制作用（图3）。

图3 转染siZFAS1能够促进安罗替尼抑制A549肝转移作用（*P＜0.05）

2.4 siZFAS1促进安罗替尼对非小细胞肺癌细胞系肝转移的抑制作用

进一步对siZFAS1作用的分子机制进行了检测，结果如图4。转染siZFAS1能够在A549细胞中上调E-钙黏蛋白（细胞上皮特征标识物）（图4A）的表达，并下调N-钙黏蛋白（图4B）和波形蛋白（细胞间质特征标识物）（图4C）的表达。表明siZFAS1能够抑制A549细胞的上皮-间质转化。

图4 转染siZFAS1能够抑制A549细胞的上皮-间质转化作用

3 讨论

肺部肿瘤主要是小细胞肺癌、非小细胞肺癌和其他肿瘤肺转移等[10]，其中非小细胞肺癌最为多发。非小细胞肺癌又分为腺癌、大细胞肺癌及鳞癌等3类，腺癌是最常见的非小细胞肺癌，占患者总数的80%以上[11]。因此，我们选取A549细胞（腺癌亚型非小细胞肺癌来源的细胞系）这一最为公认与常用的细胞系作为研究模型。

当前，分子靶向治疗是中晚期非小细胞肺癌的主要治疗策略之一，临床使用的药物主要是各类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）拮抗剂[12]，包括吉非替尼（gefitinib，易瑞沙）、埃克替尼（icotinib，凯美纳）及厄洛替尼（erlotinib，特罗凯）等[13-15]。最近的研究表明，血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）[16]等可能是非小细胞肺癌治疗新的有希望的靶标，新型分子靶向药物安罗替尼引起了广泛关注[17]，但其治疗费用昂贵，也有可能带来毒副作用。因此，研究探讨安罗替尼增敏的干预策略具有重要意义，不仅有利于实现药物增效、降低药物用量，也有可能缓解服用药物带来的潜在毒副作用。

NOTCH信号通路是恶性肿瘤治疗的新型靶点，其与肿瘤细胞治疗耐受、上皮-间质转化等密切相关[18]。NOTCH信号通路的异常活化能够使恶性肿瘤细胞具有更为强烈的耐受作用，以应对各种抗肿瘤治疗策略。NOTCH信号通路的活化机制目前尚不清楚，lncRNA ZFAS1被认为是与NOTCH活化有关的调节因子。lncRNA、竞争性内源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）及微小RNA（microRNA，miRNA）等非编码RNA是表观遗传学修饰的重要组成部分，也有可能是患者个体差异的可能来源，是研究的热点与重点[19-21]。

综上，我们的研究结果显示，在A549细胞中转染siRNA能够促进安罗替尼对A549细胞的杀伤作用，并抑制A549细胞的上皮-间质转化作用。本研究加深了我们对非小细胞肺癌中NOTCH-lncRNA调控的认识，也为安罗替尼增敏等研究奠定了坚实基础。