miR-34a靶向调控c-MET促进胰腺癌发展的分子机制及临床意义

倪晨明 邵卓 倪灿荣 熊杰 王欢 胡昊 金钢

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约为21～25个核糖核苷酸的非编码内源性小单链RNAs分子，通过与靶基因3′末端非编码区互补结合调控其在细胞内的表达水平，广泛参与多种细胞生理和病理过程，如细胞周期、凋亡、分化等[1-2]。miR-34a是经典的抑癌微小RNA[3-5]。为此，本研究检测胰腺癌BxPC3细胞、胰腺癌组织及匹配的癌旁正常组织miR-34a表达，明确miR-34a调控的靶基因，分析miR-34a及其靶基因的表达与胰腺癌临床病理参数的关系以及对BxPC3细胞增殖和转移能力的影响。

资料与方法

一、组织标本及胰腺癌细胞株培养

选取2013年3月至2016年6月间上海长海医院肝胆胰外科行手术切除的148例经病理证实的胰腺癌组织标本，其中男性75例，女性73例，年龄40～85岁，中位年龄61岁。高中分化102例，低分化46例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期138例，Ⅲ～Ⅳ期10例。取同期配对的癌旁经病理证实无癌细胞的正常胰腺组织20例。所有入组患者术前均未接受任何针对肿瘤的治疗。

人胰腺癌细胞株BxPC3购自中科院上海细胞所，常规培养、传代。取对数生长期细胞，分为对照组、miR-34a过表达组(miR-34a组)和c-MET基因沉默组(c-METsi组)。

二、方法

1．miR-34a结合位点的确定：利用Targetscan在线软件预测发现c-MET的3′非编码区(3′-UTR)存在miR-34a结合位点。采用Promega公司的pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression系统构建c-MET-3′UTR双荧光素酶(luciferase)报告载体，按说明书分别克隆c-MET的野生型3′UTR及突变型3′UTR。采用脂质体法转染BxPC3细胞，获取firefly荧光素值与Renila荧光素信号值，以两者比值表示荧光素酶活性，以对照组的活性为100%计算。

2．miR-34a组及c-MET si组BxPC3细胞株建立：miR-34a mimic及c-MET siRNA均购自上海吉玛制药技术公司，采用脂质体方法将它们分别转染BxPC3细胞。Lipofectamine 3000购自Invitrogen Life Technologies公司，按说明书操作。

3．miR-34a及c-MET mRNA表达检测：应用miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司，Cat.217004)抽提各组细胞总RNA；应用miRNeasy FFPE Kit(Giagen公司，Cat. 217504)抽提石蜡组织标本总RNA。miR-34a检测先用TaqManTMMicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems Life Technologies公司，Cat. 4366596)反转录，再用TaqManTMUniversal Master Mix II, with UNG(Cat. 4440038)及miR-34a Taqman探针(Assay ID：000425)行茎环特异性荧光定量PCR反应。c-MET mRNA检测先用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa公司，Cat. RR037A)反转录，再用 SYBR®Advantage®qPCR Premix(TaKaRa公司，Cat. 639676)行荧光定量PCR反应。c-MET上游引物序列5′ -GTAAGTGCCCGAAGTGTA-3′，下游引物序列5′-TTTCTTGCCATCATTGTC-3′；内参GAPDH上游引物序列5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游引物序列5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。 以上所有操作均按试剂盒说明书进行。采用公式2-△△Ct计算mRNA表达量。

4．c-MET蛋白表达检测： 收集各组对数生长期细胞，用裂解液抽提细胞总蛋白，应用BCA法定量后常规行蛋白质印迹法检测c-MET蛋白表达，以GAPDH为内参。抗c-MET、GAPDH抗体均购自CST公司，最后ECL发光，X片曝光、显影、定影。用Image J软件分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白表达量。

取胰腺癌及匹配的癌旁组织切片，采用免疫组织化学法检测c-MET蛋白表达，以PBS代替一抗作为阴性对照。兔抗人c-MET多克隆抗体购自Abcam公司(Cad:ab74217，1∶50稀释)， 兔抗鼠HRP多聚物二抗购自丹麦DAKO公司，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司。由2位病理科医师采用双盲法阅片。高倍镜下(×400)随机观察5个视野，胞质或胞膜出现黄色或棕黄色颗粒为c-MET阳性，根据阳性细胞所占比例(10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分)及染色强度(无染色为0分，黄色为1分，深黄色为2分，褐黄色为3分)进行评分，两分值相乘，0～4分定为c-MET阴性，5～12分定为c-MET阳性。

5．细胞增殖实验：取各组对数生长期细胞，以每孔1×105细胞接种96孔板，分别培养1、2、3、4 d，每时间点设5个复孔。培养到时间后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，继续培养4 h，上酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度值。实验重复3次，取均值。

6．细胞迁移实验：应用Transwell小室检测细胞迁移能力。取各组对数生长期细胞，用无血清培养液洗涤2次，上室内加入1×105个/ml的细胞悬液500 μl，下室加600μl含15% FBS的DMEM完全培养液，常规培养24 h，弃去上室内液体，用棉棒擦拭去上室底部隔膜表面覆盖的细胞，隔膜用50%甲醇液固定15 min，PBS洗3遍，用结晶紫染色30 min，风干，镜下随机取6个视野计穿膜细胞数，取均值。

三、统计学处理

结 果

一、miR-34a直接作用靶点的证实

对照组、miR-34a组c-MET野生型3′UTR细胞的荧光素酶活性分别为100%、(65.00±4.04)%，对照组、miR-34a组c-MET突变型的荧光素酶活性分别为100%、(106.70±7.27)%，miR-34a组c-MET野生型的3′UTR较对照组显著下调(t=8.66，P=0.001)，而c-MET突变型3′UTR与对照组比较差异无统计学意义(t=0.92，P=0.4107)，证实c-MET是miR-34a的靶基因。

二、各组细胞及胰腺癌和癌旁组织miR-34a、c-MET表达

20对匹配的胰腺癌和癌旁正常胰腺组织miR-34a表达水平分别为0.026±0.003、0.050±0.005，癌组织显著低于癌旁正常组织，平均下调1.92倍，差异有统计学意义(t=4.03，P=0.003)。

对照组、miR-34a组BxPC3细胞c-METmRNA表达水平分别为0.085±0.009、0.045±0.003；c-MET蛋白表达量为1.133±0.120、0.400±0.058(图1)，miR-34a组较对照组显著下调，差异均有统计学意义(t=4.46,P=0.011；t=5.500，P=0.005)。

图1 对照组(1)、miR-34a组(2)BxPC3细胞 c-MET蛋白表达

三、胰腺癌组织miR-34a、c-MET蛋白表达与临床病理参数的关系

以所有胰腺癌标本miR-34a表达的中位数为界分为高表达组和低表达组，根据c-MET表达情况分为阳性组和阴性组。图2显示了胰腺癌与癌旁正常胰腺组织c-MET的蛋白表达。miR-34a高表达、c-MET阳性表达与胰腺癌TNM分期、肿瘤分化程度高度相关，而与其他临床病理参数无显著相关性(表1)。

图2 胰腺癌(2A)及癌旁正常胰腺组织(2B)c-MET蛋白表达(免疫组化 ×200)

表1 miR-34a、c-MET表达与胰腺癌临床病理参数的关系

四、miR-34a、c-MET表达对胰腺癌细胞增殖及转移的影响

对照组、miR-34a组和c-METsi组BxPC3细胞生长曲线见图3，培养第4天，miR-34a组和c-METsi组较对照组的细胞增殖活力显著下降(t=4.446，P=0.0012；t=7.869，P=0.0001)；穿膜细胞数显著减少(231±12比351±16，t=5.981，P=0.0039；259±7比351±16，t=5.181，P=0.0066；图4)，差异均有统计学意义。

讨 论

miR-34a在多种肿瘤的发生和发展中起到了重要作用，但其与胰腺癌关系报道较少。本研究发现相比癌旁正常组织，miR-34a在胰腺癌组织明显下调；此外，本研究也发现低水平miR-34a与肿瘤分期及细胞分化程度成正相关，提示miR-34a可能在胰腺癌细胞增殖、侵袭等生物学过程中起到关键调节作用。高增殖活性是肿瘤重要的恶性生物行为之一[6-7]。研究发现miR-34a可调控如胃癌[8]、卵巢癌[9]、子宫内膜癌[10]及胶质瘤[11]等肿瘤细胞增殖。本研究发现在胰腺癌BxPC3细胞中过表达miR-34a后，细胞增殖活性显著减弱。转移是肿瘤生物学行为的另一个重要特征。本研究同样发现胰腺癌BxPC3细胞中过表达miR-34a后，肿瘤细胞转移能力显著降低，提示miR-34a对胰腺癌具有重要的抑制作用。

图3 对照组、miR-34a组和c-METsi组BxPC3细胞的生长曲线

图4 对照组(4A)、miR-34a组(4B)和c-METsi组(4C)的穿膜细胞比较

利用在线预测软件发现c-MET的3′UTR存在miR-34a结合位点。c-MET是胰腺癌重要的预后因子，高水平的c-MET往往提示患者预后不良[12-13]。研究发现，c-MET与其配体肝细胞生长因子受体结合引起酪氨酸的自身磷酸化，激活多条信号通路，调控肿瘤细胞的增殖、转移和侵袭；此外c-MET还和血管内皮生长因子受体一起协同参与新生血管的形成[14]。本研究发现，c-MET在胰腺癌组织中阳性率达33.7%(50/148)，并且与胰腺癌临床分期及细胞分化程度成正相关；抑制c-MET表达后，细胞增殖及转移能力明显下降，表明c-MET对胰腺癌有显著的促进作用。进一步研究发现，过表达miR-34a可下调c-MET的转录及蛋白表达水平；双荧光素酶报告载体系统也提示miR-34a可与c-MET的3′UTR直接作用而发挥抑制作用；组织检测也发现miR-34a与c-MET表达呈负相关，提示胰腺癌发展过程中，逐渐下调的miR-34a不足以抑制c-MET表达，导致其部分活化，而促进胰腺癌发生。

综上所述，miR-34a在胰腺癌中低表达，而其靶基因c-MET表达增高，两者表达呈负相关，并与临床分期及肿瘤分化程度高度相关。体外实验表明过表达miR-34a或抑制c-MET后可显著减弱胰腺癌细胞增殖及转移活性，表明miR-34a的抑癌活性可部分通过抑制c-MET得以实现，miR-34a及c-MET有望成为胰腺癌新的诊治靶点。