谷氨酸诱导大鼠胃Cajal间质细胞自噬模型的建立*

谭人千， 张 智▲， 宁海恩， 张丽敏， 王 远， 凌江红, 2△

(1广西医科大学第一附属医院， 广西 南宁 530021；2上海市浦东新区周浦医院， 上海 200120)

大量研究表明[1]，胃肠Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)作为胃肠活动的起搏者和调节者广泛分布于胃肠道，并作为胃肠道内神经传递的中介，参与神经兴奋的传递。ICCs的增殖、分化以及数量和结构的改变，可导致胃肠动力障碍性疾病，如功能性消化不良、胃轻瘫、假性肠梗阻和胃食管反流病等。自噬是机体内一种保护性机制，在应激状态下可将损伤的细胞器和细胞进行清理，维持机体的稳态。当细胞自噬过度时可启动细胞程序性死亡，从而导致细胞数量的减少，因此从自噬方面研究ICCs对理解胃肠动力障碍性疾病的机制有重要意义。本课题组前期动物实验已证明ICCs自噬可导致功能性消化不良[2-3]，因此构建ICCs自噬模型为进一步研究胃肠动力障碍的机制提供细胞模型基础。目前，谷氨酸的兴奋性毒性已得到证明，并且已有谷氨酸诱导神经元自噬损伤的模型[4],但尚缺乏构建ICCs自噬的模型。为此，本研究用谷氨酸对胃ICCs进行干预，通过CCK-8法检测细胞活力，透射电镜检测自噬体和超微结构的变化，Western blot和免疫荧光实验检测自噬标志蛋白LC3的表达，进一步探讨ICCs自噬模型的建立。

材 料 和 方 法

1 实验动物

SPF级SD大鼠30只，雌雄不限，体重200 g左右，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(桂)2014-0002。

2 主要试剂

M199培养基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；Ⅱ型胶原酶、大鼠干细胞因子(stem cell factor，SCF)和L-谷氨酸(Sigma)；胰蛋白酶、青-链霉素混悬液、D-Hanks缓冲液和抗荧光淬灭封片液(杭州吉诺生物医药技术有限公司)； CCK-8试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒、Western blot的I抗稀释液及DAPI溶液(即用型)(碧云天生物技术研究所)；抗兔IgG和兔抗鼠微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)抗体(Novus)；兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗体(Pierce)； Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG(联科生物公司)；抗GAPDH抗体(SAB)；抗兔及抗小鼠荧光 II 抗(LI-COR Biosciences)。

3 方法

3.1原代培养大鼠胃ICCs 参照参考文献[5-6]，取SD大鼠，雌雄不限, 禁食不禁水8 h，10%水合氯醛按3 mL/kg腹腔注射麻醉后无菌开腹取胃, 沿胃小弯剪开, 用D-Hanks缓冲液(含双抗)清洗3遍, 在解剖显微镜下用锐性镊子剥去胃黏膜层, 将胃肌条剪碎至0.1 cm×0.1 cm大小，加入Ⅱ型胶原酶消化液(用不含血清的M199培养基配制，终浓度1.3 g/L)于37 ℃恒温水浴箱中消化胃组织碎块50 min左右, 1 000 r/min、5 min离心弃上清，D-Hanks缓冲液重悬并吹打5 min, 再离心弃上清, M199完全培养基(含M199培养基、10%胎牛血清、1%双抗、0.5 mg/L两性霉素B和25 μg/L干细胞因子)重悬细胞并过200目筛网, 加入等量的Ficoll 400密度梯度液，1 000 r/min 离心7 min, 最后调整细胞密度为1×109/L, 每个25 cm2的培养瓶接种4 mL，于37 ℃、CO2培养箱内培养，24 h后换液, 冲去未贴壁的细胞, 此后每隔3 d换液1次。取对数生长期细胞进行下一步实验。

3.2ICCs的免疫荧光鉴定 取对数生长期细胞，经冰冻甲醇固定10 min, 5%脱脂奶粉封闭10 min; 加入兔抗大鼠c-Kit蛋白多克隆抗体(1∶100)，4 ℃冰箱孵育过夜，PBST液冲洗3遍, 加入 II 抗(Dylight 488 Conjugated Goat anti-Rabbit IgG，1∶200)，37 ℃培养箱避光孵育1 h，PBST清洗3遍, 最后加抗淬灭封片液封片，置荧光显微镜下观察并拍照。

3.3CCK-8法检测不同浓度谷氨酸对ICCs活力的影响 取对数生长期ICCs，经0.25%胰蛋白酶消化并收集离心。重悬计数后接种于96孔板，每孔接种1×104的细胞量，24 h后换液并分别加入高、中和低浓度(分别为10 mmol/L、5 mmol/L和2.5 mmol/L)的谷氨酸，每组重复6孔，于培养箱培养24 h后，分别加入10 μL CCK-8 孵育4 h后，酶标仪以450 nm为检测波长、630 nm为参比波长, 采用单步测量法测其吸度光(A)。

3.4Western blot检测自噬标志蛋白LC3的表达水平 取生长对数期ICCs, 经胰酶消化离心后计数，并接种2×105个细胞至25 cm2的细胞培养瓶中，贴壁24 h后，更换新的培养基, 并给予高、中和低浓度谷氨酸分别干预3 h、6 h和24 h后，经预冷PBS洗涤3次，每次5 min，用微量移液器吸净残余PBS, 加入100 μL含1% PMSF的RIPA细胞裂解液，细胞刮子收集细胞及蛋白, 冰浴30 min,4 ℃、12 000 r/min离心20 min，吸取上清液, BCA法测量蛋白浓度，取100 μg蛋白与相应量的上样缓冲液混合，沸水变性5 min后放置冰上备用。蛋白经12% SDS-PAGE分离胶和5% SDS-PAGE浓缩胶分离后转移至0.45 μm的PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，加入抗LC3 抗体(1∶1 000)及抗内参照GAPDH抗体(1∶1 000) 4 ℃过夜，洗膜3次，每次5 min，加入远红外荧光 II 抗(1∶10 000)，37 ℃孵育1 h，洗膜3次，每次5 min，最后使用Odyssey双色红外成像系统进行扫膜成像, 通过Quantity One软件对Western blot条带进行定量分析。

3.5透射电镜检测谷氨酸诱导后ICCs的自噬体和超微结构的变化 取对数生长期的ICCs，经胰酶消化离心后计数接种至6孔板中，每孔接种1×106的细胞量，贴壁24 h后，弃去孔内旧培养基，加入中浓度谷氨酸与ICCs作用3 h后，经预冷PBS洗涤3次，每次3 min。使用胰蛋白酶消化细胞并收集离心去上清，最后加入3%戊二醛、1%锇酸双重固定，丙酮逐级脱水及二甲酸二丙烯酯包埋，超薄切片处理，使用透射电镜进行观察和摄图。

3.6免疫荧光法检测谷氨酸诱导后ICCs自噬蛋白LC3的表达 取对数生长期的ICCs，经胰酶消化离心后计数，接种至含无菌圆形盖玻片的24孔板中，每孔接种5×103个细胞，贴壁24 h后，加入中浓度谷氨酸与ICCs孵育3 h，弃去旧培养基，PBS清洗，用预冷的多聚甲醛固定10 min，PBST清洗3次,每次5 min，再加入5%脱脂奶粉封闭10 min，PBST清洗3次；将玻片置于染色盒内，加入兔抗鼠LC3抗体(1∶100)，37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，加入 II 抗：FITC标记羊抗兔抗体(1∶200)避光置于37 ℃孵育30 min。PBST清洗3次，再加入DAPI染液室温孵育10 min，最后加抗荧光淬灭液封片，荧光显微镜下观察LC3的表达。

4 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行数据处理和统计分析。实验重复3次以上，数据均以均数±标准差(mean±SD)表示，进行方差齐性检验，两组间均数比较采用Student’st检验，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 ICCs免疫荧光鉴定

免疫荧光染色对ICCs内特异性c-Kit蛋白染色，可鉴定培养的原代ICCs。普通显微镜和荧光显微镜下ICCs特征明显，胞体呈三角形、菱形，核大，核周胞质较少，胞体可见2个以上长突起，相互连接并与周围细胞紧密相连；荧光显微镜下c-Kit蛋白呈阳性表达，胞体明显着色，呈绿色阳性显色,见图1。

2 不同浓度谷氨酸对ICCs活力的影响

与空白对照组相比，谷氨酸各浓度组所测得的A值均显著降低(P<0.01)；此外，中、高浓度组所测得A值均显著低于低浓度组(P<0.01)，而中浓度与高浓度组间差异无统计学显著性，见图2。

Figure 1. Immunofluorescence identification of ICCs. A: morphology of ICCs under phase-contrast inverted microscope (×40); B～D: morphology of ICCs under fluorescence microscope (B:c-Kit immunostaining,×40; C: c-Kit immunostaining,×200; D: DAPI staining, ×200).

Figure 2. The viability of ICCs treated with glutamic acid. Mean±SD.n=6.##P<0.01vscontrol group；&P<0.05vslow dose group.

3 不同浓度的谷氨酸作用于ICCs不同时间后自噬蛋白LC3的表达

与空白对照组比较，中、高浓度谷氨酸分别干预不同时间均可显著提高自噬蛋白LC3-II/LC3-I的比值(P<0.01)，其中以中浓度谷氨酸干预作用3 h的LC3-II/LC3-I比值最高(P<0.01)，随着作用时间的增加，细胞自噬活性相对逐渐下降(P<0.01)，见图3。

4 ICCs内自噬体和超微结构的变化

透射电镜下，空白组ICCs内可见丰富的线粒体和内质网等细胞器，未见明显的自噬体或自噬溶酶体；谷氨酸中浓度3 h组可见明显的自噬泡，自噬体内可见未被完全消化的细胞器，并且细胞质内空泡增多，线粒体和内质网等细胞器数量明显减少，见图4。

Figure 3. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ in the ICCs treated with glutamic acid at different concentrations for different periods. Mean±SD.n=3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vshigh dose group；△△P<0.01vs24 h group；▲▲P<0.01vs6 h group.

5 ICCs内自噬蛋白LC3荧光表达量的比较

正常细胞内自噬蛋白LC3呈均匀性低水平表达；谷氨酸中浓度组的ICCs可见LC3的表达增强，并在胞浆中聚集呈斑点样，LC3的平均荧光强度较空白组显著增强(P<0.01),见图5。

讨 论

谷氨酸是维持机体正常生理功能、参与多种蛋白质合成及神经递质传递的重要氨基酸。谷氨酸在动物脑部含量最多，并作为兴奋性氨基酸被认识；而过量的谷氨酸由于其兴奋毒性和氧化应激的损伤可诱导神经元自噬[7]。孟晶等[8]研究发现谷氨酸可损伤视网膜神经细胞，随着细胞外谷氨酸浓度增加，细胞膜上的谷氨酸受体被激活，进而导致钙离子内流，不断增加的钙离子可激活钙调蛋白依赖性激酶介导的自噬[9]。过量的谷氨酸导致正常细胞自噬性损伤，与机体在不良应激时导致的损伤有相似之处。因此应用谷氨酸可以更好地模拟外界不良应激对ICCs产生的作用，从而诱导自噬。本实验以谷氨酸作用于体外培养的SD大鼠胃ICCs，CCK-8法检测结果提示各浓度谷氨酸均可降低ICCs的活力，且中、高浓度组的细胞活力均显著低于低浓度组。

自噬标志蛋白LC3是目前为止在哺乳动物中被了解最透彻的一种自噬相关蛋白。在细胞中有2种存在形式，分别为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，前者位于胞浆内，而后者位于自噬泡膜表面。在自噬体形成过程中，LC3-Ⅰ与自噬膜的磷脂以酰胺键进行结合，形成LC3-Ⅱ参与自噬膜的合成。Sou等[10]研究显示去除LC3-Ⅱ将不能形成完整闭合的自噬体结构，故LC3-Ⅱ对于自噬体的形成十分必要。发生自噬时LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值与自噬泡数量成正比，故常作为评估细胞自噬强弱的重要依据[11]。本实验用Western blot法检测不同浓度、不同作用时间ICCs内自噬蛋白LC3的表达，结果表明中浓度(5 mmol/L)谷氨酸作用3 h时ICCs自噬活性最强。为继续验证谷氨酸在此浓度及时间下的作用效果，我们通过透射电镜及免疫荧光观察，显示谷氨酸中浓度组较空白组出现了明显的自噬泡，细胞质内空泡增多，细胞器减少，并且自噬蛋白LC3荧光表达显著增强，说明本实验成功诱导了ICC的自噬。根据实验结果我们发现，中、高浓度谷氨酸作用3 h时自噬活性最强，而作用6 h和24 h时自噬活性相对逐渐下降，这可能与自噬保护作用有关，细胞发生应激性反应初期，由于细胞内产生大量受损的亚细胞器、错误折叠蛋白等，细胞自噬活性增加，通过自噬清除这些废物[12]，而随着时间延长，错误折叠蛋白和细胞器被清除后，细胞逐渐恢复稳态，细胞自噬的活性随之而逐渐减弱。

Figure 4. The autophagosomes/autophagic vacuoles and ultrastructure of ICCs observed under transmission electron microscope (×30 000). ▲： initial autophagic vacuoles (AVi)； →： degrading autophagic vacuoles (AVd).

Figure 5. Observation of LC3 in the ICCs of each group under fluorescence microscope (×200). Mean±SD.n=20.##P<0.01vscontrol group.

总之，本实验证明了谷氨酸可以诱导大鼠胃ICCs的自噬，其最佳作用浓度和时间分别为5 mmol/L和3 h，为进一步研究ICCs自噬的分子机制及相关药物的研发提供了有效的细胞模型。