虫草素通过ERK1/2、Ezrin和Akt信号通路抑制胆囊癌细胞SNU-308的增殖和迁移*

刘特思， 吕 游， 闫文帝， 王 雪， 刘小庆， 朴英实, 2， 林贞花, 2， 任香善, 2△

(1延边大学肿瘤研究中心，2延边大学医学院病理学教研室，3吉林市中心医院内分泌科，吉林 延吉 133002)

胆囊癌是一种来源于胆囊上皮细胞的恶性肿瘤，其易转移、预后差、早期症状不典型，临床上大多数患者确诊时已为中晚期[1]。目前，胆囊癌治疗方法有限，外科手术切除是唯一有效的根治方法[2]，因此寻找一种高效、低毒且副作用小的治疗药物迫在眉睫。

近年来，中医中药治疗在肿瘤治疗中的作用越来越受到重视。虫草素(cordycepin)是分离提取自冬虫夏草和蛹虫草等多种虫草的核苷类似物，具有免疫调节、抗菌抗炎和抗肿瘤等[3-5]多种生物活性。研究证实，虫草素可通过抑制mRNA合成，诱导细胞凋亡，从而抑制肿瘤的生长[6]。目前，尚未有文献阐明虫草素抑制胆囊癌SNU-308细胞增殖和迁移的分子机制。

本研究旨在探究虫草素对胆囊癌SNU-308细胞增殖和迁移的抑制作用，并阐明其相关机制，为虫草素在临床上治疗胆囊癌提供实验依据。

材 料 和 方 法

1 细胞系和试剂

1.1细胞系 胆囊癌细胞SNU-308购自韩国细胞株银行。

1.2主要试剂 虫草素购自Sigma-Aldrich，用DMSO配制成浓缩液，分装保存于-20 ℃冰箱；抗FasL、Bax、Bcl-2、细胞色素C (cytochrome C，Cyto C)、cleaved caspase-3、LC3、beclin 1、Akt、p-Akt、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2、Ezrin和p-Ezrin抗体均购自Cell Signaling Technology；抗β-actin抗体购自Abcam；抗Fas抗体购自Proteintech；DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和Opti-MEM培养基购自Gibco；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BD；Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自Gene Copoeia；Ezrin小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)试剂购自广州市锐博生物科技有限公司；Lipo 3000购自Invitrogen。

2 主要方法

2.1细胞培养 SNU-308细胞用DMEM培养液(含10%胎牛血清和1%青-链霉素)培养，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中常规培养。

2.2MTT实验 取对数生长期的SNU-308细胞，以每孔10 000个接种于96孔板，实验设置0、5、10、20和40 μmol/L虫草素用药组，每组设置6个平行孔。在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养24、48和72 h后每孔加入MTT(5 g/L)溶液，继续培养4 h，小心吸取上清，加入200 μL DMSO充分振荡，用全波长分光光度计在波长490 nm处检测吸光度(A)值。

2.3平板集落形成实验 取对数生长期的SNU-308细胞，常规消化细胞，以每孔500个的细胞密度接种于6孔板中，次日更换为完全培养液及含5、10和20 μmol/L虫草素的培养液，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养7 d，用PBS缓冲液清洗2次，4%多聚甲醛固定，Giemsa染液染色，自然干燥后，进行拍照并进行统计分析。

2.4Annexin V/PI染色检测细胞凋亡 取对数生长期的SNU-308细胞接种于35 mm 培养皿，待细胞生长至70%左右融合时，分别给予对照组和用药组细胞0、5、10和20 μmol/L的虫草素工作液，继续培养48 h，诱导细胞凋亡；阳性对照组加入10 μmol/L的H2O2处理2 h。常规消化收集细胞，进行Annexin V-FITC和PI染色，用C6流式细胞仪进行检测。

2.5Western blot实验 分别给予对照组和用药组细胞0、5、10和20 μmol/L的虫草素处理48 h，提取细胞总蛋白，取40 μg蛋白行8%～10% SDS-PAGE，电转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉中封闭1 h，分别加入I抗 [Fas (1∶1 000)、FasL (1∶1 000)、Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)、Cyto C (1∶1 000)、cleaved caspase-3 (1∶1 000)、LC3 (1∶1 000)、beclin 1 (1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、Akt (1∶1 000)、p-ERK1/2 (1∶2 000)、ERK1/2 (1∶1 000)、p-Ezrin (1 ∶1 000)、Ezrin (1∶2 000)和β-actin (1∶3 000) ] 4 ℃过夜，加HRP标记的 II 抗室温孵育1 h，ECL显色发光检测。

2.6免疫荧光染色 取对数生长期的SNU-308细胞，接种于8孔细胞培养载玻片，用20 μmol/L的虫草素处理24 h，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100处理10 min，3% BSA封闭30 min，加入抗LC3抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜，再加山羊抗兔IgG(H+L) (1∶500)室温孵育1 h，DAPI 染细胞核，封片后拍照观察。

2.7细胞划痕实验 取对数生长期的细胞接种于24孔板中，待细胞生长至80%～90%融合后，用不含血清的培养液饥饿处理细胞6～8 h。用200 μL的灭菌枪头呈“1”字形进行划痕，PBS清洗后，更换为0、5、10和20 μmol/L的虫草素工作液，继续培养，在0 h、24 h和48 h进行拍照，记录划痕宽度。

2.8细胞迁移实验 取对数生长期的SNU-308细胞，制备2×108/L的细胞悬液，取100 μL接种于Transwell小室中，待细胞贴壁后，上室分别加入含1% FBS的0和20 μmol/L虫草素工作液，24孔板下室加入600 μL含10% FBS的培养液，继续培养18 h，4%多聚甲醛固定，苏木素染色，自来水脱色，无水乙醇脱水后，取出小室，棉签擦净未迁移的细胞，切下小室薄膜，拍照观察。

2.9Ezrin基因沉默对SNU-308细胞迁移的影响 取对数生长期的SNU-308细胞接种于35 mm 培养皿，待细胞生长至30%～50%融合后，用2 mL Opti-MEM培养基、5 μL Lipo 3000和5 μL Ezrin siRNA(50 nmol/L)混合液继续培养48 h，做后续Western blot实验和划痕愈合实验。

2.10Akt和ERK1/2抑制剂对SNU-308细胞迁移的影响 取对数生长期的SNU-308细胞，分别用5 nmol/L的ERK1/2抑制剂GDC-0994和5 μmol/L的Akt抑制剂Akti-1/2处理48 h，做划痕愈合实验，分别在0 h、24 h和48 h拍照。另取对数生长期的细胞，分别用5和10 nmol/L的GDC-0994及1和5 μmol/L的Akti-1/2处理细胞，后续Western blot实验。

3 统计学处理

本研究所有数据用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示；多组间数据的比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较采用LDS-t检验；2个独立样本间的比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 虫草素显著抑制胆囊癌SNU-308细胞活力和集落形成能力

不同浓度的虫草素作用于胆囊癌细胞SNU-308 24 h、48 h和72 h后发现，与0 μmol/L组相比，各用药组均可显著抑制胆囊癌细胞的活力，且在同一时点，随药物浓度增加其抑制效果更加显著(P<0.05)，见图1A；与0 μmol/L组相比，分别加入5、10和20 μmol/L虫草素处理细胞7 d后，SNU-308细胞的集落形成能力明显降低(P<0.05，P<0.01)，见图1B，结果提示，虫草素可抑制胆囊癌细胞的活力和集落形成能力。

Figure 1. Cordycepin inhibited the growth of SNU-308 cells. A: the cell viability was measured by MTT assay; B: the representative images of colony formation treated with cordycepin in SNU-308 cells were showed and quantitatively analyzed. Mean±SD.n=3.* P<0.05，** P<0.01vs0 μmol/L group.

2 虫草素诱导胆囊癌细胞SNU-308凋亡

流式细胞术分析结果显示，经5、10和20 μmol/L的虫草素处理48 h后，与对照组相比SNU-308细胞的凋亡率明显增加(P<0.05，P<0.01)，见图2A;Western blot实验结果显示，在线粒体途径中，抑凋亡因子Bcl-2表达下调，促凋亡因子Bax表达上调，细胞色素C表达上调(P<0.05)；而在死亡受体途径中，死亡受体Fas及其配体FasL和cleaved caspase-3的蛋白水平均上调(P<0.05)，见图2B，提示虫草素通过内外源性途径诱导细胞凋亡,抑制肿瘤生长。

3 虫草素诱导胆囊癌细胞SNU-308自噬

免疫荧光检测结果显示，与对照组相比，经20 μmol/L虫草素处理的SNU-308细胞的胞浆中，其自噬相关蛋白LC3绿色荧光颗粒数量明显增多，荧光强度也明显增强，见图3A；Western blot法检测自噬相关蛋白LC3和beclin 1的蛋白表达结果显示，与对照组相比，虫草素作用于胆囊癌细胞48 h后，beclin 1的表达上调，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值增高(P<0.05)，见图3B,说明虫草素可诱导胆囊癌细胞自噬。

Figure 2. Cordycepin induced the apoptosis of SNU-308 cells. A: the SNU-308 cells treated with cordycepin were stained with Anne-xin V-FITC/PI and their apoptosis was analyzed by flow cytometry; B: the effects of cordycepin on the levels of apoptotic proteins in the SNU-308 cells were detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,** P<0.01vs0 μmol/L group.

Figure 3. Cordycepin induced the autophagy in the SNU-308 cells. A: immunofluorescent staining of LC3 in green was observed in the SNU-308 cells treated with 20 μmol/L cordycepin. DAPI was used to stain the nuclei (×1 800). B: the effect of cordycepin on the levels of autophagy proteins in the SNU-308 cells was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.* P<0.05vs0 μmol/L group.

4 虫草素抑制胆囊癌细胞SNU-308的迁移能力

划痕愈合实验结果显示，5、10和20 μmol/L虫草素处理SNU-308细胞24 h和48 h后，与对照组相比，药物处理组细胞的横向迁移距离明显缩短(P<0.05)，见图4A；Transwell实验结果显示，20 μmol/L虫草素处理SNU-308细胞18 h后，其纵向细胞迁移能力明显受到抑制(P<0.05)，见图4B，结果提示，随着时间和浓度的增加虫草素可抑制SNU-308细胞的迁移。

5 虫草素通过调控Akt、ERK1/2和Ezrin的磷酸化水平抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移

Western blot实验结果显示，经5、10和20 μmol/L的虫草素作用于胆囊癌细胞48 h 后，p-Akt在20 μmol/L时的蛋白水平低于对照组(P<0.05)，而Akt表达无明显差异；p-ERK1/2在用药后的蛋白水平明显降低(P<0.05)，ERK1/2的表达无明显差异；p-Ezrin在20 μmol/L时的蛋白水平低于对照组(P<0.05)，而Ezrin表达无明显变化，见图5A，提示虫草素抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移可能与调控Akt、ERK1/2及Ezrin磷酸化水平相关。当SNU-308细胞用5 nmol/L的ERK1/2抑制剂GDC-0994及5 μmol/L的Akt抑制剂Akti-1/2处理48 h后，胆囊癌细胞的迁移能力明显受到抑制，见图5B。

6 Ezrin基因沉默可抑制胆囊癌细胞的迁移

Ezrin基因沉默48 h后，胆囊癌细胞的迁移能力明显受到抑制(P<0.05)，见图6B。Western blot实验结果显示，Ezrin基因沉默后，p-Akt的蛋白水平下降，而p-ERK1/2的蛋白水平并无改变；GDC-0994处理后p-Ezrin的蛋白水平下降；但Akti1/2处理后p-Ezrin的蛋白水平无明显变化，见图6A、C。以上结果说明Akt是Ezrin的下游因子，而ERK1/2是Ezrin的上游因子，3者共同参与抑制胆囊癌SNU-308细胞的迁移过程。

Figure 4. Cordycepin inhibited the migration ability of the SNU-308 cells. A: wound healing assays were used to detect the migration length of SNU-308 cells treated with cordycepin(×40); B: migration assay of SNU-308 cells(×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

讨 论

胆囊癌是恶性程度最高的胃肠道肿瘤[7]。多项研究证明，虫草素可作为一种新型抗肿瘤药物，对乳腺癌、肝癌和肺癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用[8-10]。本研究结果显示，虫草素有效抑制了胆囊癌SNU-308细胞的活力及其集落形成能力，提示虫草素可抑制胆囊癌的异常生长。

凋亡和自噬是细胞程序性死亡的2种死亡方式，可共同作用于肿瘤细胞，促进肿瘤细胞死亡。Yu等[11]证明虫草素通过诱导细胞凋亡和自噬来抑制非小细胞肺癌的生长。本研究通过流式细胞术分析发现虫草素可诱导胆囊癌细胞凋亡，Western blot结果进一步证实，虫草素处理后，激活内外源性凋亡途径，可见Bax和Cyto C表达上调，Bcl-2表达下降；Fas和FasL表达升高；cleaved caspase-3的蛋白水平上调，说明虫草素可通过内外源性途径共同诱导胆囊癌细胞凋亡。当细胞发生自噬时，LC3-I向LC3-II转化，细胞胞浆中LC3-II累积增多，LC3-II/LC3-I的比值上调[12]。免疫荧光实验证实，SNU-308细胞经虫草素处理后，胞浆内LC3绿色荧光颗粒明显增多，Western blot实验证实LC3-II/LC3-I的比值增高，而另一自噬标识蛋白beclin 1的表达上调，说明虫草素诱导SNU-308细胞的自噬。以上结果提示，虫草素可通过诱导细胞凋亡和自噬来抑制胆囊癌细胞的异常生长。

Tao等[13]研究证实，虫草素对人肺癌细胞的增殖和转移具有强烈的抑制作用。本研究结果也显示，虫草素可有效抑制胆囊癌细胞的迁移能力。

Akt信号通路和ERK1/2信号通路是肿瘤研究中的经典信号通路，参与调节细胞增殖、迁移、凋亡和自噬等多种生物学功能。研究发现，p-Akt和p-ERK1/2在胆囊癌中呈高表达[14-15]。本研究发现，虫草素可明显下调Akt和ERK1/2的磷酸化水平，提示虫草素抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移与调控该信号通路相关。此外有研究表明，Ezrin与肿瘤细胞的迁移关系密切[16]，且Ezrin在胆囊癌中呈高表达[17]。本研究发现虫草素也可下调Ezrin的磷酸化水平，提示虫草素可通过调控Ezrin来抑制胆囊癌细胞的迁移。

Figure 5. The effects of cordycepin on the protein levels of p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2, p-Ezrin and Ezrin in the SNU-308 cells. A: the expression level of p-Akt, Akt, p-ERK1/2, ERK1/2, p-Ezrin and Ezrin after treated with cordycepin in SNU-308 cells determined by Western blot; B: wound healing assays were used to detect the effect of ERK1/2 inhibitor GDC-0994 and Akt inhibitor Akti-1/2 (×40). Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group;△P<0.05vscontrol group.

为了进一步验证Akt、ERK1/2及Ezrin在迁移中的作用机制及3者之间的相互关系，本研究分别观察了GDC-0994、Akti-1/2和Ezrin基因沉默对SNU-308细胞迁移的影响，结果发现ERK1/2和Akt信号通路及Ezrin均参与了虫草素抑制细胞迁移的过程。Western blot实验证实，Ezrin是ERK1/2的下游因子，是Akt的上游因子，综上，虫草素通过调控ERK1/2，Ezrin和Akt信号通路共同参与抑制胆囊癌细胞SNU-308的增殖和迁移过程。

综合以上研究结果，我们将虫草素对胆囊癌细胞的增殖和迁移的分子机制做一概述。虫草素通过激活Fas/FasL系统，继而激活外源性细胞凋亡途径，促使细胞产生凋亡；与此同时，虫草素活化内源性细胞凋亡途径中的凋亡因子，其中Bax被激活，抑凋亡因子Bcl-2被抑制，线粒体膜通道打开，诱导细胞色素C从线粒体中释放，促使下游caspase家族蛋白活化，caspase-3切割活化形成cleaved caspase-3，从而诱导细胞凋亡。此外，虫草素促进beclin 1与早期细胞自噬体膜结合，在Agt4的帮助下，LC3-I向LC3-II转化，后者与磷脂酰乙醇胺结合，进而促进自噬小体的形成，诱导细胞自噬，与细胞凋亡共同促进胆囊癌细胞的死亡，抑制其增殖。综上所述，虫草素可直接或间接作用于ERK1/2、Ezrin和Akt信号通路，抑制其磷酸化，进而抑制胆囊癌细胞的增殖和迁移，有望在临床上用于胆囊癌的治疗。

Figure 6. The effects of Ezrin siRNA on the migration of the SNU-308 cells. A: the effects of Ezrin siRNA on the protein levels of Ezrin, p-ERK1/2,ERK1/2,p-Akt and Akt in the SNU-308 cells were determined by Western blot; B: wound healing assay was used to detect the effect of Ezrin siRNA (×40); C: the effects of GDC-0994 and Akti-1/2 on the protein levels of p-Ezrin and Ezrin. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsNeg siRNA group.