ADMA对交感神经损毁自发性高血压大鼠血压和肾功能的作用*

肖 冰， 杨秀春， 鲁静朝， 裴玮娜， 郭会军， 王 帆， 吴岩熹， 刘 凡

(河北医科大学第二医院心内科， 河北 石家庄 050000)

高血压是临床常见的心血管疾病之一，严重影响心脏、大脑和肾脏等重要脏器的功能。高血压肾脏损害早期起病隐匿，一旦出现临床症状，损害就会进行性加重，直至出现终末期肾病。大量的研究证明，早期发现肾脏损害并进行合理干预，可以延缓肾脏损害进展，减少心血管事件和慢性肾脏病患者总体死亡率[1-2]。

交感神经系统活性增加可能为高血压肾病的发病机制之一[3]。Ott等[4]报道,去肾交感神经术可以有效降低患者血压，而且能够改善慢性肾脏病患者肾功能。不对称二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)抑制物之一，能抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)生成，被认为是慢性肾脏病患者中心血管疾病的独立危险因素。大量研究报道，在慢性肾脏病患者体内，ADMA水平与肾小球滤过率呈负相关[5-6]。众多研究表明，在实验性高血压动物和临床高血压患者中ADMA水平明显升高[7-9]。Mallamaci等[10]报道，终末期肾病患者的血ADMA水平与去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)水平存在较强相关性。有研究显示,在清醒大鼠中，ADMA诱导交感神经激活[9]。然而，交感神经系统、ADMA与肾功能之间的关系仍然未知。因此，我们以自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)为研究对象，观察交感神经损毁SHR的血压、肾脏ADMA以及肾功能的变化，探讨高血压的发病机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂及仪器

单硫酸胍乙啶(guanethidine monosulfate)、ADMA和NE购于Sigma； TRIzol试剂购于Invitrogen。LC2010-AHT型高效液相色谱仪(日本岛津公司)；无创血压测量系统(Panlab NIBP System)。

2 方法

2.1实验动物和化学交感神经损毁术 将雄性新生SHR[北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK(京)2016-0011]随机分为对照(control)组和交感神经损毁(sympathectomized)组，每组5只。交感神经损毁组大鼠自出生后第7天开始皮下注射单硫酸胍乙啶(50 mg/kg)，连续21 d；对照组皮下注射生理盐水[11]。动物给予自由饮食，分笼饲养，明暗周期为12 h/12 h，环境温度为24 ℃。

2.2尿NE排泄量的测定 12周龄时，采用代谢笼法收集每只大鼠常温下尿液，加入浓度为1 mol/L的盐酸1 mL以避免去甲肾上腺素降解，6 h 后取出尿液，测量尿量，4 ℃、3 000 r/min离心5 min，吸取上清液1.5 mL，置于4 ℃冰箱中备用。采用高效液相色谱仪检测尿液中去甲肾上腺素含量。

2.3大鼠尾动脉无创性血压监测 分别在常温和冷应激下，使用Panlab NIBP System监测大鼠尾动脉收缩压(systolic blood pressure，SBP)和舒张压(diastolic blood pressure，DBP)，每只大鼠测量 5 次，每次间隔3 min，取其平均值作为该大鼠的血压水平。

2.4大鼠肾脏组织中ADMA及NE含量的测定 12周龄时，分别取对照组和交感神经损毁组SHR肾脏，称重后加入高氯酸(HClO4)，放入玻璃匀浆管内，冰浴下匀浆，用微型旋涡混合仪混合2 min。将匀浆液收集于离心管中．4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液于4 ℃、15 000 r/min离心20 min，取上清液，置于-80 ℃低温冻存保持。采用高效液相色谱仪检测SHR肾脏组织中NE和ADMA含量。

2.5肾脏NO含量的测定 12周龄时，切取肾脏剥离被膜后置于冰冷的生理盐水中，剪成小碎块，用生理盐水冰浴下制成组织匀浆后采用比色法测定NO含量。

2.6Western blot检测肾组织内皮型NOS (endothe-lial NOS, eNOS)的表达 12周龄时取肾脏组织50 mg，按照蛋白提取试剂盒操作说明书提取蛋白，在4 ℃下离心，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度。取相同质量的蛋白质，经SDS-PAGE，转膜，室温封闭2 h，然后分别加入兔抗eNOS抗体以及兔抗β-actin多克隆抗体，4 ℃下过夜。再用HRP-IgG杂交，洗膜后显色。凝胶成像分析系统扫描分析。以β-actin作为内参照，结果用靶蛋白与β-actin的比值表示。

2.724 h 尿微量白蛋白(microalbumin，mALB)和尿钠量测定 12周龄时，采用代谢笼法收集每只SHR常温下24 h 尿液，记录尿量，3 000 r/min低温离心15 min后取上清，置于-20 ℃低温保存待测定尿微量白蛋白和尿钠量。

2.8肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)的测定 12周龄时，尾静脉取血，代谢笼法收集尿液和记录尿量，比色法检测血液和尿液肌酐。根据血液、尿液肌酐及每分钟尿量，计算出GFR。GFR=尿液肌酐×每分钟尿量/血液肌酐。

3 统计学处理

应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，对符合正态分布和方差齐的资料，两样本均数采用t检验，若方差不齐则采用Satterthwaite近似t检验行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 化学交感神经切断术损毁交感神经的效果

常温下，与对照组相比，交感神经损毁组的SHR尿NE排泄量显著降低(P<0.01)，见图1。这一结果提示交感神经功能明显受损。

Figure 1. Comparision of urinary NE content between control group and sympathectomized group at room temperature. Mean±SD.n=5.** P<0.01vscontrol group.

2 两组SHR的SBP和DBP比较

对照组SHR的收缩压为(186.0±3.3)mmHg,舒张压为(149.6±5.9)mmHg;交感神经损毁组SHR的收缩压为(167.7±3.8)mmHg,舒张压为(125.1±6.7)mmHg，较对照组明显降低(P<0.01)，见图 2。

Figure 2. Comparison of systolic and diastolic blood pressure between control group and sympathectomized group at room temperature. Mean±SD.n=5.** P<0.01vscontrol group.

3 SHR肾脏组组中ADMA及NE含量的测定

与对照组比较，交感神经损毁组SHR肾脏ADMA和NE的含量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

Figure 3. Comparison of renal ADMA and NE contents between control group and sympathectomized group at room temperature. Mean±SD.n=5.** P<0.01vscontrol group.

4 SHR肾脏NO含量的测定

与对照组比较，交感神经损毁组SHR肾脏NO含量显著升高(2.31±0.33vs1.67±0.19，P<0.05)。

5 SHR大鼠肾脏的eNOS表达

与对照组比较，交感神经损毁组SHR肾脏eNOS的蛋白表达明显增高(P<0.05)，见图4。

6 24 h 尿mALB和尿钠量的测定

由表1可知，与对照组比较，交感神经损毁组SHR 24 h尿mALB和尿钠量的差异无统计学显著性(P>0.05)。

7 GFR的测定

由表1可见，与对照组比较，交感神经损毁组SHR 24 h尿量、尿肌酐、血肌酐及GFR的差异无统计学显著性(P>0.05)。

Figure 4. Western blot was used to determined the protein expression of renal eNOS in control group and sympathectomized group. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

表1 交感神经损毁对SHR肾功能指标的影响

GFR: Glomerular filtration rate; mALB: microalbumin.

讨 论

高血压肾脏损害的发病涉及多个机制，包括高血压促动脉粥样硬化病变、肾素-血管紧张素系统激活、氧化应激、免疫及细胞因子机制等，其中交感神经系统激活及血管内皮功能障碍是其中重要的2种[12-13]。交感神经系统能够调节内皮功能，影响NO的合成，而NO在调控血压方面及肾脏功能调节方面起着重要作用；同时，NO的合成又受内源性NOS抑制剂ADMA的限制，它能通过竞争性结合NOS影响NO的生成，从而引起内皮功能障碍；另外，大量研究证明肾功能异常患者体内往往伴随着ADMA水平的升高[14-16]。但是，ADMA、交感神经系统及肾脏功能之间的关系仍然未知。

实验结果表明，与对照组相比，交感神经损毁组SHR肾脏NO含量和eNOS表达显著升高，NE和ADMA含量均明显降低，收缩压和舒张压明显降低，表明交感神经系统抑制可引起ADMA释放减少，eNOS活性增加，NO合成升高，从而影响血压。然而，去交感神经后SHR肾脏AMDA水平下调的原因仍然未知。有研究报道，甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethyarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)主要在肾脏表达，因此肾脏功能的损伤影响DDAH的表达或/和活性可使体内ADMA的降解下调[17]。因此，本研究进一步通过检测24 h尿mALB、尿钠量和GFR评价高血压大鼠肾功能，结果显示，交感神经损毁组的SHR和对照组的SHR比较，24 h尿mALB、尿钠量和GFR均未见明显差异。这表明交感神经损毁自发性高血压大鼠中ADMA降低不是通过肾小球滤过率降低所致。

ADMA主要是在蛋白精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyltransferase 1，PRMT1)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)为甲基供体，使蛋白质多肽链中的L-精氨酸残基甲基化水解释放而来[18]。ADMA只有少部分通过肾脏排出，大部分的ADMA在DDAH和丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2(alanine-glyoxylate aminotransferase 2，AGXT2)的作用下代谢[19]。Teerlink等[8]报道，阳离子氨基酸转运体(cationic amino acid transporters，CAT)可能影响ADMA的代谢。因此，ADMA升高的可能原因有：(1)肾小球滤过率降低；(2)DDAH表达或/和活性降低；(3)AGXT2表达或/和活性降低；(4)CAT表达或/和活性降低；(5)PRMT1表达或/和活性增强。因此，是否去交感神经后SHR肾脏的DDAH、AGXT2、CAT及PRMT1的表达或/和活性受到影响从而致ADMA水平下调还需通过实验进一步验证。

综上所述，交感神经系统抑制可引起ADMA和NE释放减少，NO合成和eNOS表达升高，从而调节血压；但交感神经系统调控ADMA释放并不是通过影响肾脏功能方式来实现，其具体机制尚不清楚，仍需进一步研究。