RP-HPLC法测定消癥散中芍药苷的含量

云南省曲靖市食品药品检验检测中心，云南 曲靖 655000

乳腺包块的形成，主要与肝气郁结、痰凝血瘀、冲任失调等诸多原因有关。消癥散是曲靖市中医医院研制的制剂，主要含有柴胡、当归、赤芍、昆布、浙贝母、茯苓、白术等药物，具有调冲疏肝、清热活血、软坚散结的功效，用于治疗内分泌失调引起的乳腺小叶增生及各种原因引起的乳房包块。方中柴胡、茯苓、白术等可调理冲任，疏肝理气，昆布能软坚散结，赤芍、当归活血化瘀。诸药协同作用，可使体内分泌机能得于调整，激素水平达到新的平衡状态，从而起到良好的治疗效果。消癥散现行质量标准以薄层色谱鉴别芍药苷来控制处方中的赤芍[1-2]，未建立制剂中赤芍的含量测定方法。本研究参照文献[3-8]，以芍药苷为定量控制指标，采用反向高效液相色谱法对芍药苷进行含量测定，为有效控制“消癥散”质量提供了准确可靠且简便易行的方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 AgiLent 1200型高效液相色谱仪(包括G1311A系列四元泵，G1315D DAD检测器，G1316A 柱温箱，G1329A自动进样器)；KQ-300UDB型双频数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；METTLE MS205DU电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；一体式超纯水仪(PURELAB FLex 3，英国ELGA公司)。

1.2 试剂 芍药苷(批号:110736-201640，中国食品药品检定研究院)，乙醇为分析纯，磷酸为分析纯，水为纯化水。消癥散(批号：160905、161114、170202，曲靖市中医医院制剂室)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 ODS HYPERSIL C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以乙腈-0.1%磷酸溶液(12∶88)为流动相；流速为1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：230 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液制备 取本品内容物，混匀，取约 2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，称定重量，超声处理(频率：45 KHz，功率300 W)30 min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.2.2 对照品储备液的制备 精密称取芍药苷对照品20.25 mg，置50 mL量瓶中，加70%的乙醇适量，振摇溶解后，加70%的乙醇稀释至刻度，摇匀。即得芍药苷质量浓度为385.56 μg/mL的对照品储备液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按消癥散处方要求，分别称取除赤芍以外的其他药材，按照消癥散制备工艺，制备不含赤芍的阴性样品，并按“2.2.1”项下制备阴性样品溶液。

2.3 线性关系的考察 分别精密吸取“2.2.2”项下芍药苷对照品储备液适量，加70%乙醇稀释制成含芍药苷分别为(单位：μg/mL)：192.78、96.39、48.20、24.10、12.05的系列对照品溶液。在“2.1”项下色谱条件进样分析，以对照品浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，计算线性回归方程，得芍药苷的回归方程Y= 15.8948X+23.6027(r= 0.9997)。结果表明：芍药苷浓度在12.05～192.78 μg/mL 范围内具有良好线性关系。

2.4 精密度试验 精密吸取同一芍药苷对照品溶液(含芍药苷96.39 μg/mL)照“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积值。结果表明精密度良好，其峰面积值的RSD为0.6%。

2.5 重复性试验 取同一批次消癥散(批号160905)6份，按“2.2.1”项下的方法处理，考察方法的重复性。记录相应的峰面积，计算结果。结果表明供试品中芍药苷含量测定重复性良好，RSD为0.4%。

2.6 稳定性试验 取同一份供试品溶液(批号160905)，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下色谱条件进行分析。结果表明供试品溶液在室温下放置24 h质量基本稳定，芍药苷含量的RSD为0.9%。

2.7 回收率试验 分别取已知含量的同一批消癥散(批号160905)约 1 g，精密称定，共6份，分别精密加入对照品储备液(浓度为385.56 μg/mL)5 mL,按“2.2.1”项下的方法处理，制备供试品溶液，分别测定，计算回收率。平均回收率为 98.95 % ，RSD为1.3%。见表1。

表1 回收率测定结果 (n=6)

2.8 专属性试验 将阴性样品溶液按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，见图1。结果色谱图中在芍药苷相应出峰位置未出现干扰峰。

2.9 样品含量测定 取不同批号的供试品3批按“2.2.1”项下的方法处理，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，按上述色谱条件测定峰面积积分值，以外标法计算芍药苷的含量。见表2。

表2 样品含量测定结果 (n=3)

3 讨论

3.1 流动相的选择 实验先后试用了乙腈-0.1%磷酸，甲醇-2%醋酸溶液，乙腈-2%醋酸溶液，甲醇-0.5%醋酸溶液多个组合为流动相测定样品和对照品中芍药苷的含量，含有醋酸的流动相基线不平稳，噪声太大。乙腈-0.1%磷酸为流动相时基线较平稳，噪声小，主成分峰形较好，并且样品中的芍药苷与其他成分能很好的分离。所以本实验最后采用了乙腈-0.1%磷酸(12∶88)为流动相。

3.2 提取方法的选择

3.2.1 提取方法的确定 实验参考了《中华人民共和国药典》(一部)[2]白芍中芍药苷的提取方法，结果显示超声提取效果良好，且提取方法简单方便，加标回收率高，故选用超声提取。

3.2.2 超声时间的确定 精密称取样品(批号160905)5份，每份约2 g，置100 mL量瓶中，加入70%乙醇适量,分别超声(频率：45 kHz，功率：300 W)处理10、20、30、40、50 min后测定芍药苷含量,结果超声30 min后，芍药苷含量基本不再改变，证明样品超声处理30 min后，能将样品中的芍药苷提取完全，所以超声(频率：45 kHz，功率：300 W)时间确定为30 min。

本实验方法准确、快速、简便可靠，结果稳定，可用于消癥散中芍药苷的含量测定。