超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定乳蛋白深度水解配方粉中的泛酸

2018-08-27方富良杭州贝因美母婴营养品有限公司

食品安全导刊 2018年21期

□ 方富良李娜杭州贝因美母婴营养品有限公司

泛酸又称维生素B5、遍多酸，是一种水溶性维生素，几乎存大于所有活细胞中。泛酸在酸、碱、光及热等条件下都不稳定。具有制造抗体功能，在维护头发、皮肤及血液健康方面扮演着重要角色。目前，市场上针对特殊人群的水解蛋乳粉越来越多，其把完整的大分子蛋白进行切割，变成小分子的蛋白甚至游离的氨基酸。采用水解蛋白作为蛋白质来源的奶粉称为水解蛋白奶粉。由于大分子蛋白被水解成小分子，则在目前现有的高效液相色谱法测试泛酸的过程，蛋白小分子无法被盐沉淀，严重干扰了后续样品在液相色谱柱中的分离效果，小分子色谱峰无法与泛酸目标峰很好地进行分离。超高效液相色谱-质谱法采用多反应监测模式对泛酸进行检测，排除了小分子蛋白带来的干扰。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用购于市场上售卖的某品牌乳蛋白深度水解配方粉；乙腈（默克，色谱纯）；乙酸（国药，GR）；甲酸（SIGMA）；泛酸钙标准品（supelco）；同位素内标泛酸-13C3，15N（维生素B5半钙盐）；水系滤膜（津腾，0.22um）。

1.2 仪器与设备

UPLC-MS/MS（WATERS，I-CLASS+TQ-S）；ACQUITY UPLC HSS T3（WATERS，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；台式高速冷冻离心机（湘仪，H2050R）；万分之一电子天平（梅特勒，AL204）；数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司，KH3200E）。

1.3 方法

1.3.1 标准品（200 μg/mL）配制

称取泛酸钙21.8 mg,加水溶解至100 mL容量瓶（泛酸钙换算成泛酸系数为0.92），冰箱冷藏保存。

泛酸同位素标准溶液（100 μg/mL）：称取泛酸-13C3，15N 10 mg,加水溶解至100 mL容量瓶，冰箱冷藏保存。

1.3.2 样品处理

称取样品约1 g（精确到0.000 1 g）至50 mL棕色容量瓶中，加20 mL 50～60 ℃温水溶解，加入 1 mL乙酸溶液，超声提取20 min。取出放置至室温，加入250 μL同位素内标溶液，用乙腈定容，转移至50 mL离心管，放入至离心机以8 000 r/min离心5 min，取出过滤。用水进对滤液进行稀释200倍，涡旋振荡，用0.22 μm滤膜过滤，供上机测试。

1.3.3 测试条件

色谱柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速0.4 mL/min，柱温40 ℃，进样量2 μL。液动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱见表1。

1.3.4 质谱条件

电喷雾离子源；正离子模式；多反应监测模式；毛细管电压1.5 kV；离子源温度150 ℃；脱溶剂气温度500 ℃；脱溶剂气量800 L/h；碰撞气流速0.14 mL/min。质谱监测条件见表2。

2 结果与分析

2.1 方法验证

2.1.1 线性范围、检出限和定量限

准确吸取泛酸标准溶液，分别添加泛酸同位素标准溶液，用水稀释成浓度为0.5～10 ng/mL的标准工作液，以峰面积比和同位素浓度的乘积为纵从标、泛酸标准浓度为横从标，绘投影标准曲线。结果表明，泛酸在0.5～10 ng/mL范围内线性关系良好。线性回归方程为y=1.44389x+1.14868，相关系数r=0.99916。根据仪器的检出限（定量离子S/N=3）及定量下（定量离子S/N=10），结合样品的前处理过程，计算得到方法检出限为方法定量限，分别为0.02 mg/100 g和0.08 mg/100 g。