温经止痛巴布膏乙醇提取工艺研究

2018-08-24张瑞堂张红梅金永新马肖康玉龙田新华

中医药学报 2018年4期

张瑞堂，张红梅，金永新，马肖，康玉龙，田新华

(甘肃省第二人民医院，甘肃兰州 730000)

温经止痛巴布膏系由祖师麻、白芍、怀牛膝、透骨草等十七味中药组成，其中祖师麻、白芍为君药，该药处方为甘肃省第二人民医院中医科经验方，临床使用多年，具有温经散寒、活血化瘀、消肿止痛之功效，在治疗腰椎肩盘突出症和腰肌劳损症等方面具有较好疗效。据文献报道[1-2]，祖师麻(DaphnsgiraldiiNitsche.)中含有祖师麻甲素、7-羟基香豆素等活性成分，芍药苷是毛根科植物芍药(PaeonialactifloraPall.)的活性成分之一[3]。二药的活性成分都具有镇痛、抗炎的功能[4-6]。笔者选取该处方中君药祖师麻和白芍中的活性成分7-羟基香豆素、芍药苷及干浸膏得率为考察指标，采用正交试验法优化乙醇提取工艺，为保证其临床用药安全有效性、工业生产及质量稳定性提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1120高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；ALC-210.4型万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；CP225D 型十万分之一电子分析天平(德国赛多利斯公司)；RE52CS型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；JY2002型百分之一电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(天津华鑫仪器厂)；HH-S26S型数显恒温水浴锅(金坛市大地自动化仪器厂)；B1210E-MT型超声波仪(美国Branson公司，功率80 W，频率50～60 Hz)；RX-95型热空气消毒箱(连云港市医疗设备厂)。

1.2 试药

祖师麻、白芍、怀牛膝、透骨草等处方药材均购于兰州复兴厚药业有限公司，均符合《中国药典》2015年版一部要求。7-羟基香豆素对照品(批号：111739-200501，供含量测定用)和芍药苷对照品(批号：110736-200731，含量以97.9%计算，供含量测定用)均购于中国食品药品检定研究院。甲醇(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)，水为纯化水(自制)，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 试验设计

选择影响工艺的主要因素料液比、乙醇浓度、提取时间为考察因素，以7-羟基香豆素、芍药苷、干膏得率的综合评分为考察指标，每个因素各选择3个水平，按照L9(34)正交试验进行优化，因素水平表见表1。

表1 因素水平表

2.2 试验方法

根据因素水平，按处方比例称取1/10的处方量药材，按L9(34)正交表安排试验，得提取液，滤过，其滤液浓缩、甲醇定容至一定体积V，吸取1/10 V体积的滤液，0.45 μm滤膜过滤，得到1～9号样品溶液备用。

2.2.1 浸膏得率的测定

按上述设定方案进行提取，得提取液，趁热过滤，滤液浓缩、甲醇定容至一定体积V，取1/10 V体积的滤液置于蒸发皿中水浴蒸干，105℃烘至质量恒定，置干燥器中冷却1 h，精密称取重量，计算浸膏得率。

2.2.2 含量测定

2.2.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm，菲罗门公司)；流动相：甲醇∶水(38∶62)；流速：0.8 mL/min；7-羟基香豆素检测波长：294 nm，芍药苷检测波长：230 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。

2.2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取7-羟基香豆素对照品1.1 mg、芍药苷对照品1.5 mg，分别置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，分别配制成每1 mL含7-羟基香豆素0.11 mg，芍药苷0.15 mg的对照品溶液，置于4℃避光保存备用。

2.2.2.3 供试品溶液的制备

按处方比列称取祖师麻、白芍、怀牛膝、透骨草等全部处方中药饮片。按正交试验设计方法进行提取后，过滤，滤液甲醇定容至100 mL容量瓶中，取10 mL定溶液用 0.45 μm滤膜过滤，滤液作为供试品溶液。

2.2.2.4 阴性对照溶液的制备

分别按处方量称取除祖师麻外的其他中药饮片和除白芍外的其他中药饮片，并按“2.2.2.3”项制备祖师麻阴性对照溶液和白芍阴性对照溶液。

2.2.2.5 系统适用性试验

精密吸取供试品溶液、7-羟基香豆素对照品溶液、芍药苷对照品溶液、祖师麻阴性对照溶液、白芍阴性对照溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪分析，按“2.2.2.1”项色谱条件进行分析。结果表明，供试品溶液中有与7-羟基香豆素、芍药苷色谱峰保留时间一致的峰；7-羟基香豆素、芍药苷保留时间分别为16.1 min和10.3 min；祖师麻、白芍阴性对照无干扰；7-羟基香豆素、芍药苷理论塔板数N>3000，分离度大于1.5。7-羟基香豆素色谱图见图1，芍药苷色谱图见图2。

图1 7-羟基香豆素HPLC图A.对照品；B.样品；C.阴性对照；1.7-羟基香豆素

图2 芍药苷HPLC图A.对照品；B.样品；C.阴性对照；1.芍药苷

2.2.2.6 线性关系考察

分别精密吸取7-羟基香豆素对照品溶液和芍药苷对照品溶液各50，100，200，300，400，500 μL，用甲醇定容至1 mL，依次吸取上述溶液20 μL，注入高效液相色谱仪按“2.2.2.1”项色谱条件进行分析，以进样量为横坐标(X)，色谱峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准线性回归曲线，得7-羟基香豆素和芍药苷线性回归方程分别为Y=1×10-7X-0.001 4，r=0.999 8；Y=2×10-7X+0.025，r=0.999 2。结果表明，7-羟基香豆素和芍药苷分别在0.11 ～1.1 μg和0.15 ～1.5 μg范围内线性关系良好。

2.2.2.7 精密度试验

精密吸取供试品溶液20 μL，重复进样5次，注入高效液相色谱仪按“2.2.2.1”项色谱条件进行分析，计算得7-羟基香豆素和芍药苷色谱峰峰面积的RSD分别为2.54%(n=5)和2.82%(n=5)；结果表明仪器精密度良好。

2.2.2.8 稳定性试验

分别吸取20 μL供试品溶液于0，2，4，6，8，10，12，24 h注入高效液相色谱仪进行分析测定， 7-羟基香豆素和芍药苷色谱峰峰面积的RSD分别为2.48%和2.68%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定良好。

2.2.2.9 重复性试验

按处方比例精密称取各味药5份，分别加热回流提取，按“2.2.2.3”项下操作制备供试品溶液，注入高效液相色谱仪按“2.2.2.1”项色谱条件进样测定，依法测得7-羟基香豆素的平均含量为0.56 mg/g，RSD为2.86%(n=5)；芍药苷的平均含量为12.23 mg/g，RSD为2.48%(n=5)。结果表明该试验方法重复性良好。

2.2.2.10 加样回收率试验

按比例称取1/10处方量的各味药材9份，分别按已知含量的80%、100%、120%加入一定量的7-羟基香豆素对照品和芍药苷对照品，按“2.2.2.3”项下方法制备供试溶液进行测定，结果显示7-羟基香豆素和芍药苷的加样回收率分别为100.18%和99.79%；RSD分别为2.19%和2.12%。结果见表2。

2.3 正交试验

分别精密吸取9份供试品溶液各20 μL，按“2.2.2.1”项下色谱条件，进样测定正交试验结果见表3。

表2 加样回收率试验(n=9)

表3 正交试验结果

注：综合评分=7-羟基香豆素含量×40%+芍药苷含量×40%+干浸膏得率×20%

2.4 结果分析

以浸膏得率和7-羟基香豆素和芍药苷的含量为考察指标，为从整体上评价各因素对各考察指标的影响，故选择对各指标测定结果进行权重处理。由于浸膏得率是控制提取工艺的一种有效的量化指标，本试验采用综合评分的计算方法，在水提工艺优化的评价指标中对上述4个指标的变化进行综合考察。设定综合评分满分为1.0，具体分布确定为浸膏得率×0.2+7-羟基香豆素×0.4+芍药苷×0.4，在此基础上算综合评分，方差分析见表4。

表4 方差分析表

注：F0.05(2,2)=19.00，F0.01(2,2)=99.00，*显著性，**极显著性

根据综合评分的极差 R值及直观分析，影响提取工艺的因素依次为提取时间、料液比、乙醇浓度；综合方差分析结果，提取时间具有显著性差异，其他影响因素无显著性差异；从实验数据和结合实际生产和节约成本及最大限度提出有效物质的前提下，得出最佳工艺条件为A1B2C2。最终确定的最佳提取工艺为，加6倍量的60%乙醇，浸泡30 min，提取60 min，提取2次。

2.5 验证试验

称取处方量中药饮片各5份，按正交试验确定的最优条件进行验证性试验，由验证试验可知：7-羟基香豆素、芍药苷和干浸膏得率的RSD分别为2.26%、1.62%和1.09%，结果表明，所优选的提取条件稳定，可行，重复性好。结果见表5。

表5 验证试验结果(n=5)

3 讨论

3.1 单因素试验条件考察

在经单因素试验考察提取次数时，考察提取了3次，经计算得7-羟基香豆素含量分别为：0.52 mg/g、0.17 mg/g、0.01 mg/g；芍药苷含量分别为：10.18 mg/g、1.72 mg/g、0.03 mg/g；干浸膏得率分别为15.20%、4.65%、0.31%。提取2次后三者检测成分的提取率均可达到98%以上，考虑到制剂车间生产的实际情况，因此最终将正交试验提取次数确定为2次，未将提取次数作为正交试验考察因素。

3.2 检测成分考察

在HPLC预试验中曾试图以祖师麻甲素、7-羟基香豆素、芍药苷为检测指标性成分，但其祖师麻甲素目标峰一直无法与干扰成分分离，而7-羟基香豆素和芍药苷可以与其他成分分离，峰形对称、有较好的分离度，且7-羟基香豆素、祖师麻甲素等成分都属于香豆素类化学成分[7]，都具有镇痛、抗炎作用[6]，故最终选择7-羟基香豆素、芍药苷为检测指标性成分。