全国中药资源普查采集女贞子样品农药残留研究

高岩,刘薇,熊慧，薛雪，刘梦楠，李向日*,魏锋*

(1.北京中医药大学中药学院，北京 102488;2.中国食品药品检定研究院中药民族药检定所，北京 100050)

我国80%中药材来源于人工栽培[1]，为了防治病虫害，栽培过程中不可避免需要使用农药，但其中部分药材在栽培过程中不合理使用农药，造成农药残留超标，给中药临床应用的安全性造成了巨大的隐患，同时也制约了中药及相关产品的发展和推广。

女贞子为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit. 的干燥成熟果实,具有滋补肝肾，明目乌发的功效[2]。其主要活性成分为萜类和苯乙醇苷类等有机类成分[3]与相关无机元素。其效果确切，临床应用范围广，是多种中成药和保健食品的原料药。2013年第四次全国中药资源普查项目发现女贞子分布区域广、产地多，各产地自然气候条件和采收加工差异等因素导致其质量参差不齐，质量控制和安全评价标准亟待进一步规范。对其质量控制研究较多，但对于女贞子农药残留相关研究较少[4]。因此，本实验建立气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法农残测定方法，测定全国第四次中药资源普查所收集的不同产地的48批女贞子样品中的229种农药残留并根据《中国药典》[2]女贞子项下含量测定的规定对其进行含量测定，为了解全国范围内女贞子农药残留现状及进一步指导女贞子栽培中农药的合理使用提供数据支撑和科学依据。

1 材料

1.1 仪器

超高液相色谱串联四级杆质谱仪(Waters，ACQUITY UPLC-Vex TQ-S MS)、十八烷基硅烷键合硅胶柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)、气质联用仪(Agilent 7890B/5977A GC/MSD)、弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)、Sartorius电子分析天平(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2 试剂

禾草敌、环草丹、草达灭(编号：GBW(E)082601，浓度为100 μg·mL-1，北京坛墨质检科技有限公司);异丙甲草胺(编号：GBW(E)082612，浓度为100 μg·mL-1，天津农业部);毒死蜱(编号：BW900808-100-N，浓度为100 μg·mL-1，北京坛墨质检科技有限公司);三唑磷(编号：GBW(E)082340，浓度为100 μg·mL-1，北京坛墨质检科技有限公司);三氟氯氰菊酯(编号：GSB05-2305-2016，浓度为100 μg·mL-1，天津农业部)乙腈(色谱级，美国Fisher公司);甲酸、甲酸铵样品共批来源于第四次资源普查采集的女贞子48批药材，经鉴定为木犀科植物女贞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果实，其中安徽7批、四川3批、云南5批、湖南13批、山西8批、河南12批，样品信息见表1。

2 实验方法

应用气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法[5]测定229种农药种类，其中采用气相色谱-串联质谱法测定144种，液相色谱-串联质谱法测定85种。

表1 样品信息

2.1 对照品贮备液的制备

分别精密移取各农药对照品贮备溶液适量，以丙酮为溶剂于100 mL棕色容量瓶中定容，混匀，作为混合对照品贮备溶液。

2.2 混合对照品工作溶液的制备

分别精密量取混合贮备液适量，加乙腈制成含各对照品为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1不同浓度系列的混合对照品溶液，现用现配。

2.3 内标贮备溶液的配制

精密量取磷酸三苯酯溶液(100 μg·mL-1)5 mL，置500 mL棕色容量瓶中，以乙腈为溶剂定容至刻度，混匀，即得。

2.4 气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)分析用内标-分析保护剂的配制

精密称取核糖酸内酯1.0 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈为溶剂溶解，定容至刻度(A液，20 mg·mL-1)；另精密称取山梨醇0.50 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈：水(1:1)为溶剂溶解，定容至刻度(B液，10 mg·mL-1)。混合上述 A、B溶液，摇匀，精密加入上述内标贮备溶液5 mL，摇匀，即得(含磷酸三苯酯约50 ng·mL-1)。

2.5 液相色谱-串联质谱法 (LC-MS/MS)分析用内标溶液的配制

精密量取上述内标贮备溶液5 mL，置100 mL棕色容量瓶中，以乙腈为溶剂定容至刻度，混匀，即得(含磷酸三苯酯约50 ng·mL-1)。

2.6 色谱分析条件

2.6.1 GC-MS/MS分析条件

色谱柱：弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)；载气：高纯氦气，柱流速1.3 mL·min-1；进样口温度：240 ℃，高压不分流进样；进样量：1 μL；升温程序：初始温度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min。

电子轰击源：70 eV；离子源温度：200 ℃；接口温度：250 ℃。

2.6.2 LC-MS/MS分析条件

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)。

流动相：流动相 A为0.1%甲酸(含5 mmol·L-1甲酸铵)溶液，流动相 B为95 %乙腈溶液(含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸铵)，梯度洗脱为0～0.2 min，70%A；0.2～10 min，70%～0%A；10～12 min，0%A；12～13 min，0%～70%A；13～17 min，70%A。流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样室温度：10℃；进样量：2 μL；离子源：电喷雾(ESI)，正离子模式；监测模式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：2.50 kV；锥孔电压：30.00 V；离子源温度：150 ℃；去溶剂温度：550 ℃；锥孔气：150 L·Hr-1；去溶剂气：1 000 L·Hr-1；碰撞气：0.14 mL·min-1；气帘气：138 kPa；碰撞气：48 kPa。

2.7 供试品溶液的制备

2.7.1 供试品溶液的提取

精密称定供试品粉末5.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入乙腈30 mL，室温条件下超声提取15 min，离心，取上清液，同法提取2次，合并上清液，40 ℃条件下减压浓缩至近干，以乙腈为溶剂溶解，定容至10 mL棕色容量瓶中，涡旋混匀，即得。

2.7.2 供试品溶液的净化

净化1:移取2.7.1提取项下制备的溶液，以微孔滤膜滤过，精密移取2 mL，置于以乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液10 mL预洗过的石墨碳黑固相萃取小柱(500 mg)，以20 mL乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，氮吹至干，以乙腈为溶剂溶解，定容至2 mL棕色容量瓶内，涡旋混匀，即得。净化2：净化1所得提取液2 mL，减压浓缩至干，以环已烷：乙酸乙酯(1∶1)溶液为溶剂溶解，定容至5 mL棕色容量瓶中，涡旋混匀，以凝胶渗透色谱(GPC)净化，进样5 mL，(GPC主要参数：填料Bio-Beads S-X3 200～400目,净化柱2.5 mm×40 cm，洗脱参数：pre run 940 s，main run 1200 s，tail run 300 s)，以环已烷：乙酸乙酯(1:1)为流动相洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至近干，乙腈溶解定容至2 mL棕色容量瓶中，供GC-MS/MS和LC-MS/MS分析。

2.8 测定

2.8.1 GC-MS/MS测定

精密量取混合对照品溶液、供试品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用内标-分析保护剂0.5 mL， 涡旋混匀，进样，即得。

2.8.2 LC-MS/MS测定

精密量取混合对照品溶液、供试品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用内标-分析保护剂0.5 mL，涡旋混匀，进样，即得。

2.8.3 空白基质校正法

对农药残留进行定量时以空白基质混合标准工作溶液。

2.8.4 空白试验

除不称取试样外，按2.7.1至2.8.2上述步骤进行。

2.9 结果分析方法及定量计算方法

2.9.1 定性分析

若样品中检测出的色谱峰的保留时间与混合对照品储备液中某种农药的色谱峰相一致，且离子对的丰度符合表2要求，则可判定样品中此种农药检出。

2.9.2 定量分析

采用内标法单离子定量计算，内标物为磷酸三苯酯，样品中农药残留的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。

表2 样品溶液中离子相对丰度的允许偏差范围

2.9.3 实际样品分析

应用所建立的实验方法，测定样品中的农药种类，需同时满足2.9.1定性分析和2.9.2定量分析的相关条件，才能确定为样品中含有此种农药残留并对其定量。

3 结果与分析

3.1 线性范围和定量限

用空白基质配制的混合标准溶液浓度，在1～1 000 ng·mL-1范围内，所有农药的线性相关系数均≥0.995。同时测定多种农药残留量时，以农药在仪器上最低的响应值计算，农药的检出限为5倍信噪比(S·N-1)，定量限为10倍信噪比，得到该方法农药的检出限为0.1～1 ng·mL-1，定量限为0.2～2 ng·mL-1，检出农残标准曲线见表3。

表3 农药标准曲线

3.2 精密度测定

取浓度为50.0 ng·mL-1的229种农药混合标样，按2.8测定项下条件，连续进样6次，测定峰面积，峰面积结果相对标准偏差(RSD)均小于5%。

3.3 加样回收率测定

精密称定不含农药残留的供试样品5.0 g，以2 μg添加水平进行回收试验，计算229种农药回收率，平行测定3次，平均回收率范围为85.1%～103.2%，相对标准偏差(RSD)范围为2.3%～5.1%。

3.4 农药残留测定结果

按照相应色谱条件对48批女贞子进行农药残留分析测定，其中仅5种农药残留被检出 ,其余农药均未检出。禾草敌(环草丹/草达灭)在湖南发现2批，云南1批；异丙甲草胺在安徽发现1批；毒死蜱在安徽发现1批；三唑磷在山西发现1批；三氟氯氰菊酯在河南发现1批。除四川地区外，其余5省区均检出含有农药残留的样品，具体结果见表4。

表4 女贞子农药残留测定结果(mg·kg-1)

4 讨论

针对女贞子中多种农药所需要的检测仪器及检测条件不同，用2种仪器方(GC-MS/MS、HPLC-MS/MS)对229种农药残留进行了测定。全国范围内的48批女贞子样品中有7批检测出农药残留，检出农药种类为禾草敌(环草丹/草达灭)3批、异丙甲草胺1批、毒死蜱1批、三唑磷1批、三氟氯氰菊酯1批，说明女贞子药材栽培过程中农药使用省份范围较广，农药使用种类多样，其中包含禁止在蔬菜上使用的毒死蜱和三唑磷。因此急需对女贞子药材栽培中的农药使用种类和残留量进行规定。