超声联合无创产前基因检测在早孕期胎儿染色体异常筛查中的价值

尹虹，李扬，罗颖，汝艳辉，邹玉芬，潘铭智

(山东省妇幼保健院 国家卫生计生委生育调控技术重点实验室 山东省优生技术重点实验室，济南250014)

胎儿染色体异常是严重的先天性疾病，开展产前诊断工作是降低新生儿染色体异常发生的重要措施。羊水细胞染色体核型检测是目前进行胎儿染色体核型分析的金标准，是产前诊断最常用的侵入性操作[1]。但羊水穿刺属于有创性操作，可导致0.2%～2.0%的孕妇发生流产、胎儿丢失[2]。产前超声检查是最常用的产前无创检查方法，而无创产前基因检测(NIPT)是分析胎儿是否有染色体非整倍体异常的一项无创检测技术，已在全球范围内得到了广泛应用。本研究就早孕期超声联合NIPT筛查胎儿染色体异常的准确性进行研究，探讨非侵入性联合筛查方法在早孕期诊断胎儿染色体异常的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 从2017年4月～2018年4月就诊于我院进行早孕期筛查的3 617例孕妇中，筛选出需行羊水细胞染色体核型检测的高危孕妇312例，年龄22～43岁，孕11～13+6周，单胎妊娠298例、多胎妊娠14例。纳入标准：早孕期超声结构异常孕妇；NIPT筛查高风险孕妇；高体质量孕妇、高龄孕妇、体外受精-胚胎移植方式受孕孕妇、双胎孕妇及合并恶性肿瘤孕妇。排除标准：因中止妊娠而未行羊水细胞染色体核型检测的孕妇；拒绝行羊水细胞染色体核型检测的孕妇；错过最佳羊水细胞染色体核型检测时机的孕妇。本研究获得医院伦理委员会审核同意，孕妇及家属对诊断方法完全知晓，并自愿签署知情同意书。

1.2 超声检查

1.2.1 超声检查方法 采用GE Voluson E10彩色多普勒超声诊断仪，二维探头，频率1.6～4.5 MHz。孕妇检查前排空膀胱，取仰卧位。对每一胎儿进行系统筛查，严格按照英国胎儿医学基金会标准进行图像采集及分析，由两名获得产前筛查资质的医生对图像进行质量控制。如因孕妇腹壁较厚等原因造成经腹部图像质量欠佳，则行经阴道超声检查，阴道探头，频率5～9 MHz。采集平面包括：①矢状切面，显示胎儿鼻骨、颅内正中矢状面、胸腹壁、脊柱的连续性及背部皮肤的完整性；②颅脑横切面，显示颅骨环状强回声、脑中线及双侧脉络丛；③胸部横切面，显示心脏位置、心尖指向、四腔心结构及注意是否有三尖瓣反流；④腹部横切面，显示胃泡、膀胱、脐带腹壁入口、脐动脉及静脉导管频谱；⑤胎儿双侧上下肢切面，观察双侧上下肢的完整性及活动状态。

1.2.2 超声判断胎儿染色体异常标准 包括胎儿超声结构异常、超声软指标异常及其他与染色体异常相关的超声指标。结构异常包括心脏畸形(明显的心脏位置异常、单心室、完全性心内膜垫缺损、典型的左心或右心发育不良)、十二指肠闭锁、颅内结构异常(全前脑)、腹壁缺损(脐疝)、马蹄内翻足等外表肢体发育异常[3]。胎儿超声软指标异常包括：脑室扩张、心室强光点、肠管强回声、单脐动脉及肾盂扩张、股骨或肱骨短小、胎儿颈部透明带的厚度(NT)增厚、鼻骨缺失、脉络丛囊肿[4]。其他超声指标包括额上颌角增大、三尖瓣反流和静脉导管a波倒置。

1.3 NIPT检测 于早孕期采集孕妇外周血10 mL，置于EDTA抗凝管中，样本收集后4 ℃条件下进行血浆分离，提取血浆中游离DNA，PCR扩增，获得对应样本的DNA文库，高通量检测，将测序结果进行生物信息学分析。通过计算测试样本待测染色体的比例与总体人群的比例之差，除以对照组中待测染色体的方差，所得值为Z值，其切值为±3。

1.4 羊水细胞染色体核型检测 在超声仪定位下，无菌操作行羊膜腔穿刺抽取羊水20 mL，离心10 min，留取0.5 mL，制成细胞悬液，加入培养基混匀，置5%CO2、37 ℃温箱行开放式培养。经适当天数更换培养液，继续培养，观察羊水细胞生长良好。向培养瓶内加入一定量的秋水仙素，使细胞分裂停止在中期，再经37 ℃低渗、固定、制片、显带、染色处理，即得到用于染色体核型分析的羊水细胞表本片，再进行计数、核型分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS24.0统计软件。以羊水细胞染色体核型检测结果为金标准，使用χ2检验分析超声、NIPT、超声联合NIPT三种筛查方案的准确性。使用受试者工作特征(ROC)曲线，计算ROC曲线下面积(AUC)，分析超声、NIPT及超声联合NIPT三种筛查方法的诊断效能。

2 结果

2.1 超声筛查结果 共判定胎儿可能存在染色体异常78例。其中结构异常26例，包括心脏结构异常11例、巨膀胱1例、腹壁裂2例、脐膨出4例、全前脑3例、心脏结构异常合并NT增厚2例、脐膨出合并NT增厚1例、先天性骨发育不良合并心脏结构异常1例、单脐动脉合并腹壁裂及心脏结构异常1例；胎儿超声软指标异常44例，包括单脐动脉8例、鼻骨缺失6例、NT增厚21例、侧脑室脉络丛囊肿3例、股骨或肱骨短小3例、单脐动脉合并鼻骨缺失1例、NT增厚合并鼻骨缺失2例；其他超声指标异常8例，包括额上颌角增大3例、三尖瓣反流3例和静脉导管a波倒置2例。

2.2 NIPT筛查结果 筛查出高风险共计31例，其中21-三体综合征(简称21-三体18)高风险15例、18-三体综合征(简称18-三体)高风险12例、13-三体综合征(简称13-三体)高风险4例。

2.3 染色体核型分析结果 共检测出染色体异常27例，其中21-三体15例、18-三体9例、13-三体2例、Turner综合征1例。31例NIPT高风险人群中，经染色体核型分析确诊为染色体异常者共26例，包括21-三体15例、18-三体9例、13-三体2例。

2.4 三种筛查方法的准确性比较 超声、NIPT、超声联合NIPT三种筛查方法的准确性分别为34.6%(27/78)、87.1%(26/31)、93.1%(27/29)。超声准确性低于其他两种方法(P均<0.01)，NIPT与超声联合NIPT检测的准确性差异无统计学意义。

2.5 超声、NIPT及超声联合NIPT筛查方法的诊断效能比较 超声联合NIPT具有最高的AUC。见表1。

表1 三种方法诊断胎儿染色体异常的AUC

3 讨论

尽早发现并诊断胎儿的严重结构异常及染色体异常，不仅能够减轻孕妇家庭及社会的经济负担，而且也能够在孕妇与胎儿尚未建立亲密情感之前，最大程度减轻孕妇的身心伤害。对临床医师来说，能够争取一定时间，建立最佳临床决策。目前，大多数地区进行产前筛查主要在妊娠中期采用血清学方法筛查胎儿染色体异常，及孕20～24周时采用超声筛查胎儿结构异常，如果筛查发现异常，则通过羊水穿刺或超声进行诊断，以降低缺陷儿的出生率。但是因中孕期筛查和诊断异常胎儿一旦确诊，终止妊娠的孕周较大，对母亲身心影响也较大。Nicolaides等[5]提出，应将产筛改变为倒金字塔模式，不再将重点放在中晚孕，而是将筛查的核心放在早孕期，强调早孕期检查不仅能诊断或提示大部分严重的结构异常，还能通过超声软指标发现大多数染色体非整倍体的胎儿。羊水穿刺、培养后进行传统的染色体核型分析，为目前国内外公认的诊断染色体疾病的金标准[6]。但中孕期进行羊水穿刺为一种创伤性诊断方法，介入性穿刺本身具有一定的风险性，其并发症主要包括流产、羊水自穿刺孔渗漏、胎儿损伤、宫内感染、母体损伤等，其中0.2%～2.0%的羊水穿刺可能导致流产、胎儿丢失[2]。另一方面，羊水穿刺能够增加孕妇及家属的焦虑和精神负担，孕妇对羊水穿刺的接受程度不高。因此，寻求另一种无创伤、孕妇接受程度高的方法评价胎儿是否有染色体异常具有重要意义。

产前超声检查对于降低出生缺陷、提高人口整体质量具有重要作用。随着超声仪器分辨率及超声诊断医师水平的不断提高，使得在早孕期对胎儿进行全面评估并诊断较严重畸形成为可能。早孕期超声筛查主要包括两部分内容，筛查非整倍体染色体异常和筛查严重结构异常。国际妇产科超声学会(ISUOG)2013年提出，超声技术的发展尤其高频率经阴道探头的使用可在早孕期详细评价胎儿发育情况；其发布的孕11～13+6周早期胎儿超声检查操作指南中指出，早孕期超声检查可确定胎儿存活情况并测量胎儿大小以核对孕周，测量NT值协助染色体筛查，多胎妊娠时可明确胎儿数目以及绒毛膜性，并且提出早孕期还应对胎儿解剖结构进行详细探查，包括头、颈部、颜面、脊柱、胸部、心脏、腹部、腹壁、四肢以及胎盘、脐带等胎儿附属物[7]。对胎儿进行细致的早孕期筛查，不仅可检查出绝大多数的畸形，而且能够指导孕妇对染色体是否存在异常进行进一步筛查。早孕期胎儿超声筛查染色体异常的指标主要有NT增厚、鼻骨缺如、三尖瓣反流、静脉导管a波反向、额上颌角增大等。利用NT增厚筛查21-三体的灵敏度为80%，假阳性率为5%[8]。鼻骨缺如筛查21-三体的阳性似然比为146(95%CI50～434)[9]。单纯利用静脉导管a波异常筛查非整倍体染色体异常效能较低，但联合利用NT和静脉导管a波异常其筛查非整倍体染色体异常的灵敏度可达93.5%[10]。本研究中，超声筛查出的严重结构异常主要包括心脏结构异常(心内膜垫缺损、单心室、右室双出口，肺动脉瓣缺如等)、无脑畸形、先天性骨发育不良、巨膀胱、腹腔囊肿、消化道畸形、脐膨出、腹壁裂、全前脑等，同时也包括单脐动脉、侧脑室脉络丛囊肿、鼻骨缺失、NT增厚等能提示染色体异常的超声软指标，及与染色体有关的异常指标包括三尖瓣反流、静脉导管a波倒置和额上颌角增大等。这些均提示早孕期超声筛查不仅对诊断严重结构异常具有重要临床价值，对可疑染色体异常的胎儿也能及时发现，并能及时建议孕妇做进一步检查以确诊。

NIPT技术是通过抽取母体外周血检测胎儿游离DNA含量，推算染色体异常风险率。Fan等[11]首次基于高通量测序对18例样本进行分析，准确检出9例21-三体、2例18三体、1例13三体和6例染色体整倍体。随后的研究表明，无创基因检测技术对染色体非整倍体检测的特异性和敏感度分别达99%和100%，假阳性率低于5%[12,13]。本研究中，NIPT高风险31例，对21-三体的诊断准确率较高，而对于18-三体及13-三体的诊断准确率较低，可能与18-三体及13-三体的样本较少有关。

胎儿染色体异常是严重的先天性疾病，开展产前诊断工作是降低染色体异常的发生的重要措施。产前常见的遗传疾病有21-三体、18-三体、13-三体、Turner综合征、Klinefelter综合征等，羊水穿刺胎儿染色体核型分析对准确判断胎儿染色体有着重要作用。有研究表明，在高危孕妇中羊水细胞染色体异常检出率为2.80%～5.80%[14,15]。本研究发现，早孕期超声筛查胎儿染色体异常的诊断效能低于NIPT，而超声筛查联合NIPT能够提高诊断胎儿染色体异常的诊断效能，提示超声筛查联合NIPT能更好、更早地筛查染色体非整倍体异常。超声结构异常虽然能够提示染色体异常，但有些染色体异常的胎儿在超声筛查中表现为结构上未见明显重大异常。因此，早孕期超声筛查虽然能排查出胎儿严重结构问题，但对于染色体异常的筛查还需要NIPT的辅助。本研究中有1例在早孕期NIPT筛查为低风险，早孕超声提示NT增厚，行中孕期羊水细胞染色体核型分析，检查结果为Turner综合征。此病例提示尽管NIPT筛查为低风险，但是如果胎儿合并与染色体异常有关的超声表现时，也要建议孕妇进一步做羊水细胞染色体核型分析以确诊胎儿是否有染色体异常。

我们认为：①早孕期超声筛查虽然能够检查出胎儿严重结构异常，但是其也有自身局限性，对于染色体异常的胎儿，其检出率并不高，特别是21-三体的胎儿，由于缺乏特异性超声表现，超声未必有可见的结构异常。②NIPT对染色体异常筛查虽然具有一定优势，能够避免产前诊断引起的流产和宫内感染，但也有其自身局限性，能够影响孕妇外周血游离胎儿DNA的因素都能够影响到结果。③NIPT虽然能够筛查一部分染色体异常，但是对于早孕期超声筛查有异常，特别是有超声软指标异常者，应行中孕期羊水细胞染色体核型分析。④对于高体质量孕妇、高龄孕妇、体外受精-胚胎移植方式受孕孕妇、双胎孕妇及合并恶性肿瘤孕妇，即使早孕超声与NIPT筛查未见异常，也建议于中孕期行羊水细胞染色体核型分析。

综上所述，早孕期超声检查联合NIPT检测能够提高染色体异常的检出率，能够及时筛查出严重危害胎儿的结构畸形及染色体异常，为临床决策争取一定时间，同时超声检查联合NIPT检测为非侵入性的筛查，可尽可能地减轻对孕妇及胎儿的身心伤害。