BMP-2体外诱导小鼠皮肤成纤维细胞向成骨细胞分化的可行性探讨

李波翰，赵乾，刘斌，高春正，吴东进，赵延英，潘霄瀚，张颖哲

(1山东大学第二医院，济南250033；2山东大学附属济南市中心医院；3日本和歌山县立医科大学)

骨不连与骨缺损为骨折愈合过程中较难解决的并发症之一。组织工程为治疗该疾病提供了理想途径，展现出良好的前景。间充质干细胞因多效性、旁分泌作用和免疫调节特性而成为组织工程和再生医学的理想干细胞候选体。研究表明，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)在韧带骨化过程中起重要作用[1]。韧带主要为成纤维细胞，体外实验应用BMP-2是否能成功诱导成纤维细胞向成骨细胞分化，可为韧带骨化进程提供相关实验依据。新生小鼠成纤维细胞能够自我复制，也在理论上具有多向分化的潜力[2]，将成纤维细胞诱导向成骨细胞分化，并能有效表达BMP-2,则可考虑应用成纤维细胞代替间充质干细胞，作为治疗骨不连与骨缺损的种子细胞之一[3]。2017年10月～2018年3月，本研究探讨了BMP-2体外诱导小鼠皮肤成纤维细胞向成骨细胞分化的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:清洁级新生3 d小鼠(不分雌雄)3只，体质量1～2 g，昆明种，购自山东大学齐鲁医学院动物中心。主要试剂与仪器:DMEM培养基、澳洲胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液均购自美国Hyclone公司，双抗(青霉素与链霉素)购自山东大学第二医院，茜素红S购自Sigma-Aldrich公司，BMP-2、BMP-2兔抗鼠抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 成纤维细胞的培养 每100 mL细胞培养液由DMEM培养基90 mL和10%胎牛血清10 mL组成，培养液内再加入适量1%双抗溶液。取新生3 d小鼠，应用脊椎脱臼法处死，75%乙醇消毒，剪下小鼠背部皮肤，去除皮下组织，将皮肤剪成大小约2 mm×2 mm的组织块，然后放入培养皿中，滴加配制完成的细胞培养液，使培养液刚没过组织块。然后将培养皿置于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。

1.3 成纤维细胞向成骨细胞分化的诱导 将BMP-2加入配制完成的细胞培养液中，调整浓度至50 μg/L。将培养至第4代的成纤维细胞，加入含有BMP-2的细胞培养液[4]。培养12 d，每日观察细胞形态变化，应用反复贴壁法[5]纯化成骨细胞。

1.4 成纤维细胞向成骨细胞分化的鉴定 ①细胞形态观察：定期观察培养皿中细胞形态变化，并拍照记录。②钙结节检测：采用茜素红染色，茜素红可与钙盐结合生成复合物，钙结节被染色呈深橘红色。含有BMP-2细胞培养液培养6、8、10、12 d进行茜素红染色。吸出培养液，用PBS浸洗，用75%乙醇室温下固定1 h，再次用PBS浸洗，茜素红溶液室温下染色20 min，用PBS冲洗多余的染色剂，置于显微镜下观察，并用Image J进行半定量分析。③BMP-2表达检测：采用免疫荧光法，将成纤维细胞以及诱导后12 d的成纤维细胞分别接种于载有玻片的12孔板上，每孔约1 mL。PBS浸洗，4%多聚甲醛固定细胞爬片15 min，PBS浸洗，0.5% Triton X-100破膜，PBS浸洗，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30 min，每张玻片滴加一抗并放入湿盒，4 ℃孵育过夜，第2天加荧光二抗,避光孵育，PBST浸洗，湿盒中孵育1 h，PBST浸洗,滴加DAPI对标本进行染核，PBST浸洗，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1 细胞形态观察 倒置相差显微镜下观察，2 d即有细胞从组织块边缘游出，并以组织块为中心呈放射状排列。细胞形态呈梭形，细胞核显示清晰呈圆形或椭圆形，偶见少量扁平多角上皮样细胞存在，但逐渐消失。加入含有BMP-2的细胞培养液后，细胞形态逐渐发生变化，细胞形态呈梭形、多角形等多种形态，细胞胞质丰富，可见多个黑色颗粒样物质沉积于胞质内。见图1、2。

2.2 钙结节检测 含有BMP-2细胞培养液培养6 d后茜素红染色可见极少量被染成深橘红色的结节样物质；培养8、10 d后，茜素红染色被染成深橘红色的结节样物质逐渐增多；含有BMP-2细胞培养液培养12 d，茜素红染色可见大量被染成深橘红色的结节样物质。见图3。含有BMP-2细胞培养液培养6 d后茜素红染色测定染色面积比例为0.30%；培养8 d后染色面积比例为0.75%；培养10 d后染色面积比例为2.42%；培养12 d后染色面积比例为17.61%。培养12 d后，茜素红染色面积与其他三个时间点比较，差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 BMP-2表达检测 未用含有BMP-2的细胞培养液培养的成纤维细胞免疫荧光检测，未发现明显绿色荧光的阳性细胞，蓝色为被DAPI染色的细胞核。见图4。应用含有BMP-2的细胞培养液培养12 d后的成纤维细胞免疫荧光检测，可见大量含有绿色荧光的阳性细胞，蓝色为被DAPI染色的细胞核。见图5。

图1 培养2 d即有大量细胞自组织块游出(×100)

图2 加入成骨诱导液培养后细胞形态观察(×100)

注:a为含有BMP-2细胞培养液培养6 d茜素红染色结果；b为培养8 d茜素红染色结果；c为培养10 d茜素红染色结果；d为培养12 d茜素红染色结果。

图3茜素红染色结果(×40)

注:未发现明显绿色荧光的阳性细胞。

图4未用含有BMP-2的细胞培养液培养的成纤维细胞(×200)

注:可见大量含有绿色荧光的阳性细胞。

图5用含有BMP-2的细胞培养液培养的成纤维细胞(×200)

3 讨论

随着年龄增长，越来越多人群出现脊柱韧带骨化现象，并长期饱受疾病痛苦。韧带骨化的机制仍不十分明确。大多数学者认为，脊柱韧带骨化是基因与内、外环境共同作用的结果[6]。经过大量实验研究表明，BMP在体内成骨过程中扮演重要角色[7]。因此通过研究新生小鼠皮肤成纤维细胞诱导向成骨细胞分化的可能性，模拟韧带成纤维细胞骨化的过程。本研究结果也表明，在一定浓度的外源性BMP环境中，随着时间迁移，新生小鼠皮肤成纤维细胞具有向成骨细胞分化的能力。茜素红染色半定量分析结果显示，含有BMP-2细胞培养液培养12 d后茜素红染色面积与6 d、8 d、10 d的染色面积比较，差异有统计学意义。免疫荧光结果显示，诱导12 d的成纤维细胞质内有明显BMP-2表达，而正常成纤维细胞未发现有明显BMP-2表达。研究结果表明，应用成骨诱导液培养12 d后成纤维细胞具有良好的成骨细胞能力。由此脊柱韧带骨化的可能机制为：韧带组织附着于骨质上，各种因素导致脊柱退行性变，出现骨质增生，局部环境的BMP含量增加。对于附着骨质的韧带而言，即外源性BMP增加，而且韧带受到局部机械刺激增加，可导致成纤维细胞逐渐向成骨细胞分化。已经骨化的成纤维细胞又可作为BMP的来源，引起周围韧带成纤维细胞向成骨细胞分化，慢慢演变为某一节段韧带完全骨化，并引起相应症状。

骨折为骨科常见疾病，BMP-2在骨折愈合过程中对骨形成具有重要作用[8]。有研究表明，BMP-2作为骨折患者手术干预的补充可有效地促进骨折愈合、降低感染率[9，10]。创伤性骨折后，尤其局部软组织损伤严重者，骨折断端周围组织血供受到破坏，骨折愈合过程中所需物质的供应减少，造成骨折延迟愈合或是不愈合，即形成骨不连甚至骨缺损，为骨折研究领域较难课题。骨组织工程学的出现，为治疗骨不连或是骨缺损提供了良好的发展前景。研究表明，多种细胞均可作为骨组织工程的种子细胞，向成骨细胞诱导分化，并有效表达BMP-2。但有些细胞培养成本较高，取材较为困难。找到存在广泛并具备向成骨细胞分化能力的细胞是本次研究的主要方向。成纤维细胞在体内广泛存在，尤其皮肤含有大量成纤维细胞;而且该细胞易于培养，成本较低。有研究表明，韧带成纤维细胞和牙龈成纤维细胞均具备向成骨细胞分化的能力[11，12]。牙龈成纤维细胞容易被采集，培养成活率较高，经过成骨诱导后能够表达BMP-2,但是牙龈成纤维细胞向成骨细胞分化能力较弱，不能十分高效地表达BMP，对影响骨代谢的细胞因子反应性较差[13，14]。本研究从形态学观察发现，培养液中加入成骨诱导液后，细胞具备成骨细胞形态。钙结节茜素红染色以及免疫荧光检测结果表明，诱导后的细胞具备成骨细胞生物学特征，能够有效表达BMP-2并分泌相关物质形成矿化结节。因此皮肤成纤维细胞也具备向成骨细胞分化的能力，由于存在广泛易于培养，可考虑将皮肤成纤维细胞作为骨组织工程种子细胞之一研究骨不连或是骨缺损的治疗。本次实验仅研究在BMP外环境因素诱导下皮肤成纤维细胞成功向成骨细胞分化并检测BMP-2定性表达，未研究细胞成骨分化后BMP-2的定量表达、BMP诱导成纤维细胞向成骨细胞分化的具体机制以及是否有其他重要细胞因子参与，这些问题尚待进一步研究。

综上所述，本研究表明新生小鼠皮肤成纤维细胞具有向成骨细胞分化的能力，皮肤成纤维细胞有可能作为骨组织工程的种子细胞修复骨不连或骨缺损。