新型共刺激分子B7-H4表达抑制对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响

何涛,胡洪,谢楠,钱程,李春满,唐波,付必莽,李文

(1玉溪市人民医院，云南玉溪 653100;2昆明医科大学第二附属医院)

肝癌恶性程度极高，发现时多为晚期，即使手术根治性切除，多数患者5年生存率仍不足20%[1]。新型共刺激分子B7-H4是近年新发现的一种负性共刺激分子，参与肿瘤发生的多个过程，如细胞周期、增殖、凋亡等。研究发现，B7-H4在正常组织中呈低表达或不表达，而在部分肿瘤中呈高表达[1～3]。2018年3～5月，首先我们筛选出高表达B7-H4的肝癌细胞株,并进行慢病毒的转染抑制，抑制肝癌细胞株B7-H4的表达量，以期观察体外抑制该基因后对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3购自中科院昆明细胞库。PBS(20×PBS Buffer)、TBS(20×TBS Buffer)购自上海生工生物工程有限公司。细胞裂解液及胰酶消化液购自上海翊圣生物科技有限公司。DMEM、RPMI-1640培养基、蛋白定量试剂盒、二抗、ECL发光液及GAPDH单克隆抗体购自武汉谷歌生物科技有限公司。聚凝胺(Polybrene)购自吉满生物科技(上海)有限公司。慢病毒(Lentivirus)载体设计合成与验证均由上海吉玛制药技术有限公司完成。目的基因shRNA-1序列:5′-GGATATCAAAGTGACAGAATC-3′，shRNA-2序列:5′-GGAAGTGAATGTGGACTATAA-3′。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒，CCK-8试剂盒购自江苏凯基生物科技公司。B7-H4兔抗单克隆抗体购自美国Abcam公司及北京博奥森生物技术有限公司。多功能酶标仪、ECL成像系统由Bio-Rad Laboratories科技公司提供。流式细胞仪由美国BD公司提供，型号为FACSCalibur型。

1.2 肝癌细胞培养、筛选及基因沉默 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7三种细胞使用RPMI-1640培养基、10% FBS培养，PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3三种细胞用DMEM高糖培养基、10% FBS培养，以上细胞均置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中，培养基中加青-链霉素双抗。待细胞处于对数生长期且细胞融合达70%～80%时，收取细胞蛋白，使用Western blotting法筛选出高表达B7-H4的细胞株。将该细胞株使用上述方法，改用24孔板中培养，待细胞密度合适时，行慢病毒转染。将所培养的细胞随机分为三组：对照组、shRNA-1组、shRNA-2组。培养并观察细胞的生长情况，待细胞长至对数期且状态良好，各组细胞融合率达75%时，行转染操作。其中，shRNA-1组、shRNA-2组分别转染对应的B7-H4慢病毒抑制基因序列，对照组加转染试剂但不予干扰序列。具体细胞培养转染过程如下：①培养细胞并调整好细胞状态，慢病毒转染前一夜，将各肝癌贴壁细胞进行细胞计数并以1×105/孔铺到24孔板中培养，并使各肝癌细胞在转染时的总量控制在2×105/孔。②慢病毒转染时，先配制Polybrene试液，将原培养基用含有6 μg/mL Polybrene的新配培养基替换，并加入目标基因病毒悬液，继续培养。③4～6 h后，再加入1 mL新鲜培养基以稀释转染体系。④继续培养约24 h，用新鲜培养基完全替代含有慢病毒液的培养基。⑤转染48 h后，进行荧光检测(绿色荧光蛋白)，通常该荧光在72 h时最明显。我们使用并收集转染72 h时的各肝癌细胞行后续实验。

1.3 慢病毒沉默B7-H4表达效率的检测 采用Western blotting法。取各组转染72 h细胞，刮取并裂解细胞提取蛋白，进行蛋白定量测定。按照4∶1的比例取适量蛋白液和蛋白上样缓冲液混匀，沸水加热约10 min使蛋白变性。按目的蛋白分子大小配制WB胶版,并上样目的蛋白液，每孔约30 μg，按110 V恒压电泳、220 mA恒流条件转膜，转膜时间约100 min。然后将已经转好的PVDF膜置于TBS-T缓冲液中漂洗约10 s，适宜比例条件下的脱脂牛奶封闭上述膜1 h备用，再孵育B7-H4抗体和内参抗体，4 ℃条件下孵育过夜。第2天TBS-T缓冲液洗膜3次，每次10 min，TBS-T缓冲液洗膜1次，每次5 min，加入二抗，室温孵育1 h，再次按上述方式洗膜，曝光条带并分析实验结果，观察转染慢病毒抑制后的各组目的蛋白表达情况，经过实验，挑选出shRNA-2组HCCLM3肝癌细胞进行下一步实验。

1.4 慢病毒抑制B7-H4基因对HCCLM3肝癌细胞增殖能力的影响 采用CCK-8法。取上述转染72 h 细胞，按不低于1 000/孔接种在96孔板中培养，同时每组设3个复孔。按设定时间每孔加入CCK-8试剂10 μL，培养箱中继续培养1～2 h，然后在480 nm处测定各孔光密度(OD)值。并以实验测定结果绘制细胞增殖曲线，统计分析目的基因抑制后细胞增殖能力的变化。

1.5 慢病毒抑制B7-H4基因对HCCLM3肝癌细胞凋亡率的影响 肝癌细胞HCCLM3经慢病毒转染抑制1、2、3、4、5 d后，用胰酶消化液消化细胞(不含EDTA)，温和吹打并收集细胞，确保细胞总量不低于10 000个，再用事先预冷的PBS洗涤上述细胞2～3次。按照凋亡试剂盒说明分次分组加入结合缓冲液、Annexin-V，再加入PI染液重悬细胞，室温避光孵育10～30 min，上流式细胞仪检测细胞凋亡率，并采用流式分析软件FloMax 2.82版本分析实验所得结果。

2 结果

2.1 各组肝癌细胞B7-H4的相对表达量比较 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3细胞的B7-H4表达量见图1，可见6个细胞株中，HCCLM3的B7-H4相对表达量最高，为高表达B7-H4细胞株。

2.2 慢病毒转染后HCCLM3细胞B7-H4的表达情况 shRNA-1组、shRNA-2组B7-H4被抑制，且shRNA-2组抑制更明显。见图2。

图1 不同肝癌细胞系中B7-H4表达

图2 慢病毒转染后HCCLM3细胞B7-H4表达

2.3 抑制B7-H4表达对HCCLM3细胞增殖活性的影响 与对照组同时间比较，除转染1 d细胞增殖活性差异无统计学意义外，shRNA-2组HCCLM3细胞增殖活性降低(P均<0.05)。见表1。

2.4 抑制B7-H4表达对HCCLM3细胞凋亡的影响 转染后72 h，对照组凋亡率为9.63%，shRNA-2组凋亡率为43.3%，两组比较，P<0.01。

表1 两组细胞增殖活性比较

注:与对照组同时间点比较，*P<0．05，**P<0．01。

3 讨论

B7-H4是B7家族最新的新型共刺激分子，相对分子质量约为31 kD，定位于细胞质及细胞膜，以往研究多关注其在免疫过程中的效应。该分子在正常组织中不表达或低表达，在多个恶性肿瘤组织中呈高表达。研究发现，肝、肾、肺等器官B7-H4蛋白不表达，但可检测到相关mRNA的表达[1,2,4]。我们前期的研究中也发现，该蛋白在肝内胆管癌、肝癌及结直肠癌等肿瘤中高表达，与多个相关研究[2]结果相符。通过多项基于该蛋白的研究，可表明机体对B7-H4基因的调控极有可能发生在翻译水平。与此同时，B7-H4与肿瘤的发生发展、恶性表型以及肿瘤免疫密切相关[4]。

B7-H4调节细胞增殖及细胞凋亡与多个细胞凋亡相关信号分子及通路有关，我们在B7-H4与肝内胆管癌关系的研究中发现，B7-H4与肝内胆管癌的发病密切相关，高表达的B7-H4可以促进肿瘤的发生，且促进肿瘤细胞发生上皮细胞-间充质转化(EMT)，促进了细胞的侵袭转移，同时抑制肝内胆管癌细胞的凋亡。该过程的发生可能与Bcl-2/Bax比例失调有关，最终促使Caspase-3改变[2]。Qian等[5]研究发现，抑制该基因的表达，可增加细胞内促凋亡蛋白Bax表达，同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，通过调节两者的蛋白表达量及比例最终使Caspase-3、Caspase-9激活，并促进细胞凋亡发生。另外，也有研究发现，抑制该基因后，可使细胞外信号调节激酶1/2erk等的激活，并促进肿瘤细胞凋亡[2,5]，与本研究结果相似。此外，在高表达B7-H4的非肿瘤细胞中，该基因的过表达可阻断Fas/FasL信号通路途径抑制相关细胞的凋亡[6]。

研究发现，B7-H4与肿瘤细胞的增殖关系密切，过表达该基因可增强肿瘤细胞的增殖能力。Zhang等[7]研究认为，B7-H4可存在于细胞的多个部位，在细胞增殖过程中，可发生质-核穿梭过程。多数研究者认为，其基因内包含核定位序列，同时该研究者也发现，进入细胞核内部的B7-H4可影响细胞周期相关蛋白Cyclin E/D1的表达，而两者表达量的变化及相对比例影响细胞周期G/S期的转变，并最终促进肿瘤细胞增殖。Jeon等[8]研究发现，将B7-H4转染到人结肠癌SW-620及RKO细胞中，可发现上述两种癌细胞的增殖速率明显加快，且在裸鼠皮下荷瘤过程中，可发现过表达该基因的裸鼠具有明显的生长优势。Cui等[9]用As2O3抑制肝细胞癌B7-H4的表达中，发现该基因被抑制后，JAK2/STAT3信号通路即可被抑制，并最终影响肝癌细胞的生长。另外，也有文献报道，B7-H4可通过诱导缺氧诱导因子的激活促进肿瘤细胞增殖和恶性进展。同时，该研究指出高表达B7-H4促进上皮细胞的恶性转变，加速了肿瘤细胞的增殖[8]。

B7-H4过表达不仅可促使肿瘤细胞增殖，同时还可增强肿瘤细胞的侵袭、转移能力。在肝内胆管癌及结直肠癌中，我们应用慢病毒抑制技术过表达及抑制该基因的表达，可发现相关肿瘤细胞侵袭及转移能力的改变。同时也证明了结直肠癌上皮细胞的EMT转化可能是PI3K/AKT通路激活所致[2,10～13]。部分研究者使用B7-H4-RNAi转染人结直肠癌LOVO细胞株后发现，CXCL-12趋化因子受体CXCR-4和JAK2/STAT3 mRNA的转录及相关蛋白表达水平明显下调，且其细胞侵袭能力下降[10]。该研究指出，B7-H4可通过调控上述细胞信号通路，并最终增强肿瘤细胞侵袭能力的转变。我们在研究中亦发现，剔除裸鼠B7-H4基因可显著抑制裸鼠肝内肝癌细胞的肺转移倾向[2]。

本研究发现，抑制B7-H4后，HCCLM3肝癌细胞凋亡率增加，而肿瘤细胞的低凋亡率是其恶性程度的最大体现，同时肿瘤细胞的增殖在目的基因被抑制后明显降低。我们在实验中，亦发现shRNA-2组抑制B7-H4表达效率较好，抑制效果更加明显，同时观察分析shRNA-1组，可能有脱靶效应的干扰。

综上所述，慢病毒抑制HCCLM3肝癌细胞B7-H4表达可抑制该细胞增殖活性，加速该细胞凋亡，有望成为肝癌潜在的治疗靶点及治疗药物研发新方向。