酶解法检测淀粉糊化度的方法优化

The Optimization of Starch Gelatinization Enzyme Hydrolysis Method

◎ 刘 流1，周小波2

（1.盐城市食品药品监督检验中心，江苏 盐城 430070；2.天邦食品股份有限公司，浙江 宁波 315000）

淀粉糊化是指淀粉悬浮液在一定温度下，淀粉颗粒吸水膨胀，体积增大，淀粉颗粒破裂，成为黏稠状胶体溶液的过程。糊化的本质是淀粉中晶质与非晶质态的淀粉分子间的氢键断开，微晶束分离，形成一种间隙较大的立体网状结构，淀粉颗粒中原有的微晶结构被破坏[1]。糊化度是指淀粉中糊化淀粉与全部淀粉量之比的百分数。淀粉的糊化度越高，越容易被酶水解，越易被消化吸收[2]。

淀粉糊化度及糊化参数的测定，一般是根据淀粉糊化后其物理或化学特性的变化特点，如双折射现象消失、颗粒膨胀、透光率及黏度变化等。目前，主要的研究方法有酶水解法、黏度测定法、双折射法、DSC技术、近红外光谱分析技术、X-衍射以及核磁共振光谱技术等[3]。本文主要讨论酶解法，对比复合淀粉酶和单一酶β-淀粉酶的检测结果。

1 材料与仪器

1.1 供试材料

玉米淀粉，北京鸿润宝顺科技有限公司，纯度为99.5%。

1.2 试剂

β-淀粉酶：北京鸿润宝顺科技有限公司，效价为10.0万/g。Sigma淀粉脱支酶（amyloglucosidase）：Sigma，No.A-7255，浓度为12 100单位/g。碘化钾（KI）：分析纯，国药沪试。碘单质（I2）：分析纯，国药沪试。氢氧化钠（NaOH）：分析纯，国药沪试，粒状。硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H20）：分析纯，国药沪试。

1.3 仪器

分析天平（0.000 1 g），水浴锅，电炉，100 mL三角瓶，10 mL酸式滴定管，烧杯，玻璃棒，100 mL棕色容量瓶，100 mL容量瓶，500 mL容量瓶，1 000 mL容量瓶。

2 原理

2.1 β-淀粉酶酶解法基本原理

葡萄糖和碘单质反应，消耗部分碘；硫代硫酸钠滴定剩余部分碘；已知加入的碘的量，计算出消耗了多少碘，和麦芽糖的量。β-淀粉酶对糊化淀粉和原淀粉有较高选择性，仅水解糊化淀粉，不水解生淀粉；根据β-淀粉酶将糊化淀粉水解为麦芽糖，已知麦芽糖的量，计算糊化淀粉的量，糊化淀粉与全部淀粉的量之比即为糊化度。经过不同标准品验证，β-淀粉酶酶解法可以准确测量复合淀粉的糊化度。

2.2 涉及的化学反应

I2与NaOH作用可生成次碘酸钠（NaIO），次碘酸钠可将还原糖分子中的醛基定量地氧化为羧基。未与还原糖作用的次碘酸钠在碱性溶液中歧化生成NaI和NaIO3，当酸化时NaIO3又恢复成I2析出，用Na2S2O3标准溶液滴定析出的I2，可计算出还原糖的含量。具体反应式如下，

C6H12O6和NaIO定量作用：

总反应式：I2+C6H12O6+2NaOH=C6H12O7+2NaI+H2O

C6H12O6作用完后，过量的NaIO发生歧化反应：

在酸性条件下NaIO3和NaI作用：

析出过量的碘用Na2S2O3标准溶液滴定：

2.3 淀粉糊化度的计算

公式中，X：糊化度；Q：空白试验所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为mL；P1：糊化完全时所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为mL；P2：待测试样所消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为mL。

3 实验方法

3.1 材料与试剂

（1）1%淀粉溶液。取可溶性淀粉0.5 g，加水5 mL搅拌均匀后，缓缓倾入100 mL沸水中，边加边搅拌，继续煮沸2 min，放冷后倾取上层清液即得。

（2）1 mol/L盐酸。量取8.34 mL37%浓盐酸，加蒸馏水定容至100 mL。

（3）0.1 mol/L碘液。称取碘化钾3.5 g，溶于10 mL水中，然后称取碘单质1.27g溶于碘化钾溶液，充分溶解混匀后，转入棕色容量瓶定容至100 mL（保质期1个月）。

（4）0.2 mol/L NaOH溶液。称取4 g NaOH，加蒸馏水定容至500 mL。

（5）10%硫酸溶液。量取10 mL98%浓硫酸，加蒸馏水定容至100 mL。

（6）0.1 mol/LNa2S2O3溶液。称取26 g硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H20），加0.2 g无水碳酸钠，溶于1 000 mL水中，煮沸10 min，冷却，放置一周后过滤，定容至1 000 mL。

3.2 β-淀粉酶酶解法

（1）通过60目筛磨碎试样，分别称取0.5 g（如有需要进行脱糖脱脂处理）置于2个100 mL的三角瓶中，分别标记A1、A2，另取1个100 mL的三角瓶，不加试样作空白，标记为B。向这3个瓶中加入蒸馏水50 mL。

（2）把A1置于电炉煮沸（微）或沸水浴中煮沸60 min，每15 min摇匀一次，然后将A1三角瓶迅速冷却到20 ℃（夏天高温时应将A2、B与A1一起迅速冷却到20 ℃）。

（3）在A1、A2、B中各加入0.150 gβ-淀粉酶，在38 ℃水浴中保温3 h，每15 min搅拌1次，然后在3个三角瓶中迅速加入2 mL 1 mol/L的盐酸溶液，用蒸馏水定容到100 mL，过滤后作检定液用。

（4）各取检测液20 mL，分别置于3个100 mL具塞磨口三角瓶中，各加入0.1 mol/L的碘液10 mL，0.2 mol/L的NaOH溶液10 mL，然后加塞暗处静置15 min。注意：碘液不同批次不能混用；加入碘液后至滴定结束，保证每个样品实验时间一致。

（5）静置后在上述3个三角瓶中各加入10%的硫酸溶液2 mL，用0.1 mol/L Na2S2O3的标准溶液进行滴定，待试样颜色变为淡黄色时加入1%淀粉液指示剂，继续滴定至蓝色消失，记录所消耗Na2S2O3标准溶液的体积。

3.3 注意事项

①碘液不同批次不能混用。②加入碘液后至滴定结束，保证每个样品实验时间一致。③脱糖脱脂处理步骤。取样品50 g倒入250 mL三角瓶中，加入100 mL乙醚溶解后震荡1 min后过滤（重复3次），加入100 mL乙醇溶解后震荡1 min后过滤（重复3次）。将滤纸中样品倒入三角瓶中，通风橱内放置1 h后放入45 ℃烘箱，4 h后取出。

4 结果与分析

4.1 不同酶解时间玉米（颗粒生玉米）的糊化度检测

使用Sigma复合酶测量糊化度为0的玉米淀粉，Sigma淀粉复合酶添加量为1% 4 mL。不同的酶解时间进行对比，实验结果见表1。从表中数据可以看出，由于Sigma复合淀粉会缓慢水解生淀粉，故检测结果与实际差别较大，且实验得到的淀粉糊化度结果会随酶解时间的增加而增加。

表1 复合淀粉酶检测结果表

4.2 不同熟玉米淀粉比例的玉米淀粉的糊化度检测

首先制备不同糊化度的玉米淀粉标准品，分别为0%、20%、40%、60%、80%和100%，进行验证实验。每份样本中添加0.150 0 g的β淀粉酶，然后进行充分酶解，酶解时间为140 min，实验结果见表2。从表中数据可以看出，淀粉糊化度的检测结果比较准确，基本与标准品数据一致。

表2 β淀粉酶检测结果表

5 结论

实验验证了淀粉复合酶可以比较缓慢的分解生淀粉，从而影响检测糊化度的实验结果，酶解时间越长，结果数据越大。而β-淀粉酶完全不水解生淀粉，经标准品实验验证，采用β-淀粉酶进行充分酶解后，可以得到较准确糊化度结果，比复合酶的传统方法检测结果更准确；且β-淀粉酶的新方法成本较低。因此β-淀粉酶可以广泛应用于饲料质控检测，食品质控检测等领域。