芪乌调脂颗粒稳定大鼠动脉粥样硬化斑块的作用机制*

于 妍，杨阿妮

甘肃省中医院心血管病科，甘肃 兰州 730050

目前动脉粥样硬化(AS)性疾病的发病率及死亡率逐年上升，并呈年轻化趋势［1］。AS不稳定斑块破裂所形成的急性血栓是心血管恶性事件发生的主要原因［2］。有研究［3］表明，炎性因子贯穿粥样斑块形成的开始、过程和最终破裂的全过程。C-反应蛋白(CRP)是一种重要的心血管炎性标志物，相关研究［4］发现，CRP在斑块破裂、不稳定型心绞痛的发生中发挥了重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是由炎症细胞分泌的可降解基质的蛋白酶，其具有促进粥样斑块纤维帽中基质成分降解的作用，从而加速斑块破裂。基质金属蛋白酶9(MMP-9)是MMPs家族中的重要成员,在粥样斑块处的血管重构、斑块的不稳定及其破裂中扮演着重要角色［5］。近年研究［6］发现，斑块内新生血管形成与As斑块的稳定性密切相关，As斑块内常出现病理性新生血管，它们可能促进粥样硬化病变的发展，甚至诱发斑块内出血和斑块破裂及其并发症的发生。

本研究“以方测证”，观察芪乌调脂颗粒对炎症因子、MMPs、VEGF的影响，及对维持斑块稳定性的作用，为中医药防治AS的作用环节和作用靶点提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1实验药品芪乌调脂颗粒(生黄芪、制首乌、泽泻、郁金、生山楂、决明子、片姜黄、水蛭等组成，每包含生药6 g，由甘肃省中医院制剂科制备，登记号：2013Y0228)；阿托伐他汀钙片(北京嘉林药业股份有限公司，批号：130127，10 mg/片)。

1.2实验动物健康SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量(200±20)g，由甘肃中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：医动字第0000852号。

1.3实验试剂胆固醇(上海伯奥生物科技有限公司，批号：20130122)；胆酸钠(上海源聚生物科技有限公司，批号：20131102)；丙基硫氧嘧啶(南通制药总厂，批号：130514)；超敏C反应蛋白(hs-CRP)ELISA试剂盒［尚柏生物医学技术(北京)有限公司，批号：20131207］；兔抗鼠 MMP-9(产品编号：AW0219，批号：20130324)，兔抗鼠 VEGF(产品编号：BA0407，批号：20130315)，二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(产品编号：AR1022，批号：20130223)，牛血清白蛋白(BSA)封闭液(产品编号：DS0619，批号：20130315)，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.4实验仪器Tissue-Tek.VIPTM5Jr全封闭组织脱水机(日本，樱花检验仪器株式会社)；Tissue-Tek.TECTM5组织包埋机(日本，樱花)；AO型切片机(美国，赛默飞)；OLMPUSCHC-212型双目生物显微镜(日本，奥林巴斯)；ALCYON300全自动酶标仪(美国，雅培)；LD4-2A型高速台式冷冻离心机(中国，北京京立)；PYX-DHS-50×60型隔水恒温培养箱(中国，上海跃进)；WKY型 5-25 μL型微量移液器(中国，上海荣泰)；BI-2000型医学图像分析系统(中国，成都泰盟)。

1.5实验方法

1.5.1 动物分组与给药 健康SPF级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体质量(200±20)g，采用随机数字表法分为5组，每组16只，分别为：空白组(生理盐水)；模型组(生理盐水)；芪乌调脂颗粒组(芪乌调脂颗粒3 g/kg，相当于临床用量10倍)；阿托伐他汀组(阿托伐他汀1.7 mg/kg，相当于临床用量10倍)；芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组(芪乌调脂颗粒3 g/kg+阿托伐他汀1.7 mg/kg，相当于临床用量10倍)；造模成功后将上述药物按10 mL/kg灌胃给药，1次/d，连续8周。

1.5.2 模型制备及取材 适应性饲养1周后开始造模，模型组、芪乌调脂颗粒组、阿托伐他汀组、芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组(芪乌+阿托组)给予高脂饲料(81.3%基础饲料、10%猪油、5%白糖、3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.2%丙基硫氧嘧啶)，同时腹腔注射维生素D3注射液60万U/kg，分3天完成；空白组给予基础饲料(麸皮25%、面粉20%、豆料20%、玉米 20%、米粉 10%、骨粉 3%、鱼粉 2%)，同时腹腔注射等容量生理盐水，分3天完成。4周后从模型组和空白组各取2只处死，用于检验造模是否成功。

末次给药后大鼠禁食不禁水，24小时后各组大鼠采静脉血2 mL，测定血脂各项。股动脉取血2 mL，全血在6 000 r/min条件下离心5分钟，取血清测定hs-CRP。将大鼠脱颈处死后取主动脉组织置于10%甲醛溶液中，待检。

1.6指标检测

1.6.1 各项检测指标 采用酶法测定甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。

1.6.2 光镜检查主动脉病理形态切片 用10%甲醛固定主动脉血管，脱水，石蜡包埋；将石蜡包埋的组织用病理切片机切成厚5 μm石蜡切片；脱蜡、水化；HE染色。

1.6.3 血清hs-CRP的测定 采用ELISA法测定大鼠血清中hs-CRP含量，用酶标仪在450 nm处测定OD值，根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。

1.6.4 SABC法检测主动脉组织切片中MMP-9、VEGF的表达 石蜡切片滴加3%H2O2，室温静置5～10分钟以消除内源性过氧化物酶的活性；热修复抗原：将切片浸入0.01 M枸橼酸盐缓冲溶液(pH 6.0)的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸15～20分钟，室温冷却 20～30 分钟，PBS(pH 7.2～7.6)液洗涤3分钟×3次；滴加5%BSA封闭液，室温20分钟。甩去多余液体，不洗；滴加一抗(兔抗鼠MMP-9、兔抗鼠VEGF)，37℃1小时左右，PBS(pH 7.2～7.6)冲洗，3分钟×3次；滴加生物素二抗工作液，37℃孵育20分钟，PBS冲洗3分钟×3次；滴加试剂SABC，37℃孵育20分钟，PBS冲洗，5分钟×4次。DAB显色，苏木素轻度复染，自来水冲洗中止反应；逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片；显微镜观察；计算机图像扫描半定量分析阳性信号的表达(VEGF，MMP-9以灰度值表示)。

1.7统计学方法应用SPSS 17.0统计学软件分析数据，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1一般状况各组大鼠入组时毛色白、顺滑有光泽，目红有神，对声、光、捕捉等刺激敏感。至实验结束时，空白组与入组时差别不大，体质量平均增长20%左右；模型组大鼠毛色暗黄，精神萎靡，饮食、活动少，对外界刺激反应差，平均体质量下降15%左右；芪乌调脂颗粒组、芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组、阿托伐他汀组大鼠较模型组毛色白，活动、饮食量增加，体质量较模型组略回升。

2.2对血脂的影响1)与空白组相比，模型组TC、TG、LDL-C水平上升，差异有统计学意义(P＜0.05)；2)与模型组相比，芪乌调脂颗粒组、芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组、阿托伐他汀组TC、TG、LDL-C水平降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。落，内皮下间隙增宽，内弹力层和中弹力板发生变性、断裂和崩解，内膜和中膜均出现大量斑块和炎细胞浸润；中膜明显增厚，且有钙化和泡沫细胞形成，SMC增殖明显，排列显著紊乱；外膜可见炎细胞浸润，见图1。

表1 各组大鼠TC、TG、LD L-C变化情况(±s) mg/dl

表1 各组大鼠TC、TG、LD L-C变化情况(±s) mg/dl

注：＊表示与空白组比较，P＜0.05；△表示与模型组比较，P＜0.05

组别 只数 TC TG LDL-C空白组 16 154.55±8.44 101.21±19.89 86.32±6.07模型组 16 178.91±13.41＊ 123.57±23.93＊ 111.14±10.72＊芪乌调脂颗粒组 16 148.24±15.22△ 106.76±20.92△ 81.57±9.28△芪乌+阿托组 16 145.05±13.65△ 102.09±23.39△ 80.33±6.58△阿托伐他汀组 16 146.32±14.82△ 104.13±21.22△ 82.40±7.62△

2.3.3 芪乌调脂颗粒组 内膜增厚隆起厚薄不一，内皮细胞不完整，可见脱落细胞及迁移的SMC，但较模型组明显减轻；中膜SMC增殖，内见少量泡沫细胞，多灶性钙化，较对照组显著增厚，但较模型组略变薄；外膜可见少量炎细胞浸润，见图1。

2.3.4 芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀钙组 主动脉壁层次尚清晰，内弹力板基本完整，内膜较薄，且较均匀，轻微隆起，未见脱落细胞，内膜下可见SMC增生，较模型组明显减轻，中膜层较对照组显著增厚，但较模型组明显减轻，结缔组织和平滑肌细胞内见少量泡沫细胞聚集，外膜为疏松结缔组织，见图1。

2.3.5 阿托伐他汀组 内膜厚薄不一，内皮细胞不完整，内皮下间隙增宽，可见迁移的SMC和泡沫细胞；中膜SMC增殖，有少量淋巴细胞和泡沫细胞，内皮下有少量坏死物，较模型组明显减轻；外膜可见少量炎细胞浸润，见图1。

2.3对主动脉病理形态学的影响

2.3.1 空白组 大鼠主动脉壁各层结构正常，内膜、中膜和外膜分界清楚，内皮细胞完整，管腔内膜光滑无增生，厚薄均匀，中膜弹力纤维正常，SMC排列整齐规则无增殖迁移，外膜无炎性细胞浸润，见图1。

2.3.2 模型组 主动脉管腔变小，内膜薄厚不一，可见内皮细胞脱

图1 大鼠主动脉病理形态学表现(HE，10×40倍)

2.4各组大鼠血清hs-CRP1)与空白组相比，模型组大鼠血清hs-CRP水平显著上升，差异有统计学意义(P＜0.05)；2)与模型组相比，阿托伐他汀组、芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组血清hs-CRP显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；3)与阿托伐他汀组相比，芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组血清hs-CRP降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血清hs-CRP水平(±s)

表2 各组大鼠血清hs-CRP水平(±s)

注：＊表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与阿托伐他汀组比较，P＜0.05

组别 只数 hs-CRP/(μg·mL-1)空白组 16 173.08±7.97模型组 16 350.22±51.27＊芪乌调脂颗粒组 16 301.61±22.62芪乌+阿托组 16 209.13±21.04△#阿托伐他汀组 16 243.69±21.74△

2.5对主动脉组织V EG F、M M P-9的影响

2.5.1 各组大鼠心肌组织中MMP-9免疫组化结果 空白组棕黄色颗粒极少，为弱阳性表达，模型组可见大片棕黄色颗粒，为强阳性表达，与模型组比较各治疗组胞浆中的阳性颗粒均有减少。1)与空白组比较，模型组MMP-9阳性表达显著上升，差异有统计学意义(P＜0.01)；2)与模型组比较，阿托伐他汀组、芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组MMP-9表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。3)与阿托伐他汀组比较，芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组降低MMP-9阳性表达明显，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 3、图 2。

表3 芪乌调脂颗粒对大鼠M M P-9的影响(±s)

表3 芪乌调脂颗粒对大鼠M M P-9的影响(±s)

注：＊表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与阿托伐他汀组比较，P＜0.05

组别 只数 MMP-9(灰度值)空白组 16 61.36±3.00模型组 16 143.22±3.58＊芪乌调脂颗粒组 16 131.38±3.71△#芪乌+阿托组 16 100.69±5.17阿托伐他汀组 16 112.18±5.63△

图2 大鼠主动脉组织MMP-9免疫组化结果(10×40倍)

2.5.2 各组大鼠主动脉VEGF免疫组化结果 空白组棕黄色颗粒极少，为弱阳性或阴性表达，模型组可见大片黄色颗粒，为强阳性表达，与模型组相比各治疗组胞浆中的阳性颗粒均减少。1)与空白组比较，模型组VEGF阳性表达显著上升，差异有统计学意义(P＜0.01)；2)与模型组比较，芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组VEGF表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；3)与阿托伐他汀组相比，芪乌调脂颗粒+阿托伐他汀组降低VEGF显著，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表 4，图 3。

表4 芪乌调脂颗粒对大鼠V EG F的影响(±s)

表4 芪乌调脂颗粒对大鼠V EG F的影响(±s)

注：＊表示与空白组比较，P＜0.01；△表示与模型组比较，P＜0.05；#表示与阿托伐他汀组比较，P＜0.05

组别 只数 VEGF(灰度值)空白组 16 98.71±3.05模型组 16 131.99±5.40＊芪乌调脂颗粒组 16 126.55±3.15△#芪乌+阿托组 16 104.20±5.34阿托伐他汀组 16 123.63±2.45

图3 大鼠主动脉组织VEGF免疫组化结果(10×40倍)

3 讨论

AS是动脉硬化性血管病中最常见、最重要的一种疾病，是冠心病、脑血管病等缺血性疾病的主要病理基础［7］。动脉粥样硬化的形成机制复杂，有研究［8］显示与脂质浸润、炎症反应、血管新生因素等有关，且炎症反应、血管新生与不稳定斑块的破裂密切相关。因此，降脂有利于预防、减缓动脉粥样硬化的进程，抗炎、抑制血管新生有利于稳定斑块、预防斑块破裂而导致的急性心脑血管事件［9］。

动脉粥样硬化性疾病属中医学“中风”“眩晕”“胸痹”等范畴。其病机总属本虚标实，本虚主要表现为气虚，标实主要为痰浊血瘀。芪乌调脂颗粒以中医理论为依据，发挥辨病与辨证相结合的优势，以益气、活血、排浊为法，方中重用黄芪补气行血，何首乌补肾泄浊，山楂散瘀降浊，水蛭活血破瘀，诸药合用，共奏攻补兼施，标本同治之功效，使元气旺血行畅，瘀血祛痰浊除，则脉络通。

本研究结果表明，芪乌调脂颗粒能够降低AS模型大鼠血脂，并降低模型大鼠血清中的hs-CRP的含量及MMP-9、VEGF的表达，与阿托伐他汀钙有协同治疗作用，从而影响AS大鼠的预后。从动物验模型角度论证了芪乌调脂颗粒是一种有效、安全的调脂中成药，同时具有一定的抗炎、降低病理性血管新生的作用。