酶解虾皮用于料酒生产的研究

刘姗，杨柳*，何述栋，孙汉巨，姚升飞，徐尚英

(1.合肥工业大学 食品科学与工程学院，合肥 230009；2.安徽海神黄酒集团有限公司，安徽 庐江 231561)

烹饪黄酒(即料酒)以粳米为主要原料，经过麦曲、酒曲中多种微生物的糖化、发酵酿制而成。料酒中所含的氨基酸态氮能使烹饪的菜肴口味更鲜美，适量的乙醇能使肉类中有腥膻味道的蛋白和胺类挥发掉且不破坏肉的蛋白和酯类，酯类物质能增加菜肴的香味[1]。料酒中氨基酸态氮含量与其鲜味之间相关[2]。近年来，为适应各种烹调要求，葱姜料酒、葛根料酒和五香料酒等诸多类型的调味料酒被相继开发出来[3-5]。随着消费者认知的日益理性，安全、健康的酿造料酒新产品势必受到消费者的青睐。

虾皮主要是以毛虾为主，经过蒸煮、晾晒、烘干等工序加工而成的一种食用干制品。虾皮中蛋白含量可高达40%，还富含钙、钾、碘、镁、磷等矿物质及有“超级维生素E”美誉的虾青素[6-8]。虾皮氨基酸中谷氨酸含量最高，赋予了虾皮浓郁的鲜香味[9]。目前市场上的虾味调味品主要是虾酱、虾粉等[10]，关于虾皮料酒的研究很少。虾皮溶解度低，不宜直接添加至料酒中。本研究通过对虾皮进行酶解，将虾皮酶解液作为辅料用于料酒发酵生产，开发出一款虾皮料酒。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾皮：家乐福超市；甲醛、NaOH、无水乙醇、亚铁氰化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水合茚三酮(99.9%)：美国Sigma-Aldrich公司；酿酒曲(绍兴风味)和安琪酿酒高活性干酵母(黄酒专用)：安琪酵母股份有限公司；碱性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(5×104U/g)：北京奥博星生物技术有限公司；木瓜蛋白酶(1×105U/g)：南宁东恒华道生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌锅 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；752N型分光光度计 上海第三分析仪器厂；S-4330D氨基酸分析仪 德国Sykam(赛卡姆)公司；SHP-250型生化培养箱 上海三发科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 虾皮酶解工艺优化

虾皮→烘干→粉碎→酶解→灭酶→离心(5000 r/min,10 min)→虾皮酶解液。

单因素试验：分别考察蛋白酶种类(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶)、酶添加量(0，200，400，800，1000 U/g，以每1 g虾皮干重计)、酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)、pH(5.0，6.0，7.0，8.0，9.0)、酶解时间(1，1.5，2，2.5 h)和料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20 (g/mL)]对虾皮酶解效果的影响，以其中一个因素为单因素变量，其他条件一定的前提下，进行单因素试验。

正交试验：在单因素试验的基础上，以酶添加量、酶解时间和料液比为研究对象，以氨基酸态氮含量为指标，用L9(34)正交试验来研究不同条件下的虾皮酶解效果。

1.3.2 料酒制备

取一定量的粳米，加入同等质量自来水(水质要求符合GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》)，25 ℃浸泡48 h，沥去水，取60 g浸泡后粳米(干重约40.0 g)分装于250 mL三角瓶中，加入40 mL自来水，包扎封口后，置于灭菌锅中，在0.05 MPa下保温15 min进行蒸饭。向冷却至28 ℃左右的米饭中加入0.08 g酿酒曲、0.08 g酿酒高活性干酵母和40 mL无菌水混合并搅拌均匀。在28 ℃下保温培养，每隔4 h搅拌1次，培养5天后在18 ℃下继续培养14天，得到成熟料酒发酵醪，将醪液离心，上清液即为料酒原酒液。

1.3.3 虾皮酶解液添加时间对料酒发酵的影响

在料酒发酵过程中，向米醪中添加虾皮酶解液，添加量为2.0%，添加时间分别为0，24，48，72，96 h，待料酒发酵结束后，测定料酒原酒液中的总糖含量、酒精度、氨基酸态氮含量。

1.3.4 虾皮酶解液添加量对料酒发酵的影响

将虾皮酶解液添加到米醪中，添加量分别为0，1.0%，2.0%，4.0% (酶解前虾皮干重占总物料干重的百分数)，待发酵结束后，测定料酒原酒液中的总糖含量、酒精度、氨基酸态氮含量。

1.3.5 添加虾皮酶解液对料酒中游离氨基酸的影响

将虾皮酶解液以2.0%的添加量添加到米醪中进行料酒发酵，待发酵结束后，利用S-4330D氨基酸分析仪测定料酒原酒液中游离氨基酸的种类和含量。

1.4 感官评价

请10名食品专业人员作评定员，彼此独立对虾皮料酒样品进行感官评定，互不影响，以保证结果准确。对虾皮料酒的感官评定，主要针对色泽、香气、口味和风格4个方面。每个属性的评定均采用5分制，每个属性的质量等级如下：优(4～5)、良好(3～4)、中(2～3)、差(1～2)。通过统计计算，得出产品的总体感官质量等级。

1.5 分析方法

1.5.1 酒精度的测定

蒸馏法[11]。

1.5.2 总糖含量的测定

亚铁氰化钾滴定法。

1.5.3 氨基酸态氮含量的测定

酶解液或发酵醪经离心(5000 r/min，10 min)，上清液中氨基酸态氮含量参照GB/T 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》[12]。

料酒中游离氨基酸的测定参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》[13]。

1.6 数据处理

所有试验重复3次，应用Excel软件作图，数据以平均值±标准偏差表示，采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析中的Duncan法检验。

2 结果与分析

2.1 虾皮酶解条件的研究

2.1.1 单因素试验

根据相关虾皮酶解文献的报道[14]，选取对虾皮酶解影响显著的几个主要因素如蛋白酶种类、酶添加量、酶解时间、pH值、温度和料液比等进行单因素试验，以酶解液中氨基酸态氮含量为测定指标，结果见图1。

图1 蛋白酶种类、中性蛋白酶添加量、初始溶液pH、酶解时间、酶解温度和料液比对虾皮酶解的影响

注：图1(a)中1为对照组；2为木瓜蛋白酶；3为中性蛋白酶；4为碱性蛋白酶。

由图中1中(a)可知，中性蛋白酶对虾皮的酶解效果最好。因为虾皮独特的细胞结构，用中性蛋白酶破坏其细胞壁结构从而使细胞内的呈味核苷酸和氨基酸等风味成分得到释放。由图1(b)可知，氨基酸态氮含量随着中性蛋白酶添加量的增加而增大，当添加量大于800 U/g(虾皮干重)时氨基酸态氮含量增加不明显。由图1(c)和图1(e)可知，初始溶液pH和酶解温度在中性蛋白酶最适酶解条件下效果最佳，分别为pH 7.0，50 ℃。由图1(d)可知，酶解时间为2 h时氨基酸态氮含量达到最大值0.930 g/L。由图1(f)可知，随着料液比的增加，氨基酸态氮的含量呈先增加后降低的趋势，当料液比为1∶10时氨基酸态氮的含量达到最大值0.932 g/L，因为随着料液比的增加，对酶的稀释度越来越大，酶的实际作用效果降低。

表1 虾皮酶解显著性分析结果Table 1 Significance analysis results of dried shrimp enzymolysis

注：显著性差异用“*”表示；置信水平为0.95。

对影响虾皮酶解的5个因素做显著性分析，由表1可知，中性蛋白酶添加量、酶解时间、料液比对虾皮酶解影响显著，酶解温度和pH影响不显著。因为pH值和酶解温度均在中性蛋白酶最适范围内效果最佳，属于酶的特征参数，较为确定。

2.1.2 正交试验结果与分析

在单因素试验结果的基础上选取对虾皮酶解影响显著的3个因素：酶添加量(400，800，1000 U/g)、酶解时间(1.5，2，2.5 h)、料液比(1∶5，1∶10，1∶15)作为正交试验的因素，每个因素分别取3个水平。试验以氨基酸态氮含量为评价指标，试验设计和结果见表2。

（1）政策文件方面：党和国家领导人高度重视质量信用建设工作，多次在重要场合、重要会议上强调，要坚持以质量第一为价值导向、牢固树立质量第一的强烈意识，并相继出台了多项政策性文件指导质量诚信体系建设，包括《征信业管理条例》《中共中央 国务院关于开展质量提升行动的指导意见》《质量发展纲要（2011-2020年）》《社会信用体系建设规划纲要（2014-2020年）》以及《企业质量信用评价工作方案》等。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Design and results of orthogonal test

由表2可知，在影响中性蛋白酶酶解虾皮的诸多因素中，各因素作用的主次顺序为B>A>C，即料液比的影响最大，酶添加量次之，酶解时间的影响最小，误差的影响则更小，可以忽略；最优酶解提取条件组合为A2B2C2。取最优条件做验证试验，氨基酸态氮含量为0.935 g/L，且所得酶解物鲜味浓郁。因此确定虾皮的最佳酶解条件为中性蛋白酶添加量800 U/g(虾皮干重)、料液比1∶10 (g/mL)、50 ℃、pH 7.0条件下酶解2 h。

2.2 虾皮酶解液的添加时间对料酒发酵的影响

将虾皮酶解液以2.0%添加量，添加到米醪中进行发酵，研究在不同发酵时间添加对料酒酒精度和氨基酸态氮含量的影响，结果见表3。

表3 虾皮酶解液的添加时间对料酒发酵的影响Table 3 Effects of dried shrimp hydrolysate addition time on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表3可知，在发酵72 h时添加虾皮酶解液，料酒发酵效果最佳，料酒中酒精度、总糖和氨基酸态氮的含量符合QB/T 2745-2005《烹饪黄酒》质量标准，且其中氨基酸态氮已达到优级烹饪黄酒要求(不低于0.4 g/L)。在发酵0，24，48 h时向米醪中添加虾皮酶解液，其中大量的营养物质被发酵醪中霉菌、酵母菌等微生物生长繁殖所消耗，致使发酵前期酒精度上升过快，抑制了具有糖化作用的霉菌的生长、产酶，从而不利于发酵后期酒精度的积累，也使得氨基酸态氮含量较低[15]；在发酵96 h时添加，发酵已接近尾声，添加虾皮酶解液，达不到共发酵的作用，造成料酒中残余较多的氨基酸态氮和糖，同时酒精度也较低，不利于料酒后发酵的贮藏。因此，确定虾皮酶解液的添加时间为72 h。

2.3 虾皮酶解液的添加量对料酒发酵的影响

将虾皮酶解液添加到米醪中，研究不同添加量对料酒发酵的影响，结果见表4。

表4 虾皮酶解液的添加量对料酒发酵的影响Table 4 Effects of dried shrimp hydrolysate content on cooking wine fermentation

注：n=3, P<0.05。

由表4可知，虾皮酶解液的添加量对料酒氨基酸态氮和总糖含量影响显著，且酒精度和氨基酸态氮含量与酶解液的添加量成正相关。酶解液添加量为2.0%时，氨基酸态氮含量为(0.463±0.019) g/L，较对照增加了237.96%，因为虾皮酶解液中含有大量的含氮类物质，致使料酒中氨基酸态氮含量较高，同时也为酵母生长提供了营养，以至于提高料酒的酒精度，降低醪液中的总糖含量。而且制备的料酒中氨基酸态氮的含量符合QB/T 2745-2005优级烹饪黄酒质量标准的规定。因此，选择虾皮酶解液的添加量为2.0%。

2.4 添加虾皮酶解液对料酒中游离氨基酸的影响

氨基酸不仅是料酒中主要的营养成分，还是料酒的主要呈味物质，它的种类和含量与料酒的风味及感官品质有着密不可分的联系。探究了添加虾皮酶解液对料酒中游离氨基酸种类和含量的影响，结果见表5。

表5 添加虾皮酶解液对料酒中氨基酸组成的影响Table 5 Effects of dried shrimp hydrolysate on amino acidcomposition in cooking wine g/L

注：ND表示未检测到。

根据不同种氨基酸对风味的贡献可将氨基酸分为4类[16]：甜味氨基酸(丝氨酸Ser、丙氨酸Ala、苏氨酸Thr、甘氨酸Gly、半胱氨酸Cys、蛋氨酸Met)、鲜味氨基酸(天冬氨酸Asp、谷氨酸Glu)、苦味氨基酸(精氨酸Arg、组氨酸His、缬氨酸Val、苯丙氨酸Phe、异亮氨酸Lle、亮氨酸Leu、赖氨酸Lys)、涩味氨基酸(酪氨酸Tyr)。

料酒中自身含有多种氨基酸。其中不乏一些人体必需的氨基酸，例如甲硫氨酸、缬氨酸和亮氨酸等。由表5可知，添加虾皮酶解物有利于增加料酒中呈味氨基酸的种类和含量。从氨基酸的种类来看，增加了半胱氨酸；从氨基酸的含量来看，游离氨基酸总量为4.345 g/L，较对照增加了517.19%。其中谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和精氨酸等多种氨基酸的含量增加明显，甜味和鲜味氨基酸含量之和与苦味和涩味氨基酸含量之和的比值相较于对照增加了101.18%，使得制备的料酒风味更加鲜美，既有料酒本身的酒香，又具有虾皮的鲜香，两者相得益彰。说明添加虾皮酶解液进行料酒发酵可以增加料酒中氨基酸的含量并改善料酒的风味。

2.5 产品感官指标

2.5.1 外观

橙黄色，清亮透明，有光泽，瓶底有微量聚集物。

2.5.2 香气

具有黄酒特有的浓郁醇香和虾皮的鲜香，无异香。

2.5.3 口味

醇和，鲜美，无异味。

2.5.4 风格

酒体协调，具有烹饪黄酒的典型风格。

3 结论

本文开发了一款新型调味料酒，在料酒发酵过程中添加虾皮酶解液，制备得到的料酒中氨基酸态氮含量较高且游离氨基酸种类和含量丰富。虾皮中含有大量的蛋白质和多种氨基酸，通过单因素试验和正交试验确定了虾皮的最佳酶解条件，虾皮在中性蛋白酶添加量800 U/g(虾皮干重)、料液比1∶10 g/mL、50 ℃、pH 7.0条件下酶解2 h效果最佳，虾皮酶解液中氨基酸态氮含量最高。传统方法制备的料酒中氨基酸态氮主要来源于原料粳米中蛋白质分解和酵母等微生物的自溶。将虾皮酶解液以辅料的形式添加到米醪中，增加了发酵环境中的氨基酸态氮含量，使得制备的料酒中氨基酸态氮和游离氨基酸含量大幅提高。虾皮酶解液中含有虾青素和多肽类物质，料酒的抗氧化能力还有待进一步研究。