真空包装素皮鸭的初始菌相分析与优势菌初步鉴定

张元嵩，蒋云升，王乐园，瞿文杰

(扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127)

真空包装素皮鸭是由干豆腐皮经卤水卤制，经过蒸煮、冷却、油炸、浸煮、沥干等工序后真空包装而成的即食炸卤豆腐皮，因其炸卤后豆腐皮表面颜色类似烤鸭皮，故称为素皮鸭。豆腐皮中含有45%蛋白质，14%脂肪，且具有人体所需维生素、氨基酸及微量元素，具有高蛋白、低脂肪、易吸收、营养高的特色，成为大多素食产品的主要原料[1]。近年来，由于素食的消费市场逐渐扩大，真空包装素皮鸭的销售量也在逐步提高，但因其营养丰富，易为微生物提供生长条件而导致产品胀袋变质，从而限制产品的销售范围和货架期[2]。因此，探究素皮鸭的优势腐败菌及菌相构成，从而采取针对性措施以控制其质量安全，成为企业急切需要解决的问题。

本文采用选择性培养基划线分离单个菌落，对真空包装素皮鸭的主要微生物菌群进行纯化，依照观察菌体形态和菌落特征[3]，进行生理生化实验等方法初步鉴定素皮鸭中的优势菌，从而为贮藏、运输、销售过程中对微生物生长繁殖的有效控制提供理论依据，以达到延长产品货架期的目的。

1 材料与试剂

1.1 工艺流程

每25 g素皮鸭产品分装，于4 ℃冷藏7天，随机取样进行微生物分析。

1.2 培养基与试剂

选择培养基：营养琼脂培养基、Pseudomonades培养基、MRS培养基、VRBGA培养基、MSA培养基、孟加拉红培养基：购于上海博微生物科技有限公司；革兰氏染色液、3% H2O2、0.02%甲基红、格里斯氏试剂等：由实验室配制；微量生化反应管：购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

冰箱(BCD-203型)；电子天平(DT-200型)；恒温水浴锅型(HH-8型)；恒温恒湿培养箱(HSX-250型)；全温培养摇床(QYC-200型)；生物显微镜(XSP-13A型)；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器(YX280B型)；单人双面净化工作台(SW-CJ-1F型)；电热恒温鼓风干燥箱(DHG-9148A型)。

2 方法

2.1 微生物分离与纯化

以无菌操作要求，取样品25 g剪碎，放入225 mL 0.85%无菌生理盐水中，均质20 min，取1 mL上清液，依次按1∶10递增稀释，每个稀释度做3个重复。采用平板倾注法在45 ℃下培养并每隔24 h进行菌落总数测定。从菌落总数平板上挑取典型生长菌落，在各相应的平板上划线分离，分离纯化2～3次，得到纯化的单个菌落，分别接种于相应培养基斜面保存，用于菌种的初步鉴定与观察。培养基的选择及培养条件见表1。

表1 各菌的选择性培养基及培养条件Table 1 Culture media and conditions of different bacteria

2.2 优势菌鉴定

2.2.1 菌体形态和菌落特征观察

菌体形态：革兰氏染色分阴性和阳性；芽孢形状、着生位置及芽孢囊的形状。

菌落特征：菌落大小；表面形状(光滑、皱褶、颗粒状)；隆起程度(扩展、隆起)；边缘形状(整齐、波浪状、齿轮状)；菌落形态(单个、成群、链状)；表面光泽；菌落质地(油脂状、粘稠状)；菌落颜色(乳白色、蜡黄色、粉红色、紫红色、橘红色)；透明程度(透明、半透明、不透明)。

2.2.2 生理生化实验

根据《伯杰细菌鉴定手册》[4]和《常见细菌系统鉴定手册》[5]对各菌株进行接触酶实验、葡萄糖氧化发酵(O/F)实验、精氨酸脱羧酶实验、精氨酸双水解酶实验、硝酸盐还原实验、动力实验。

3 结果与分析

3.1 优势菌的初步鉴定

3.1.1 素皮鸭中菌株的菌种特征和菌体形态

通过革兰氏染色后镜检，油镜观察各种菌体形态及其在选择性培养基上的菌种特征，结果见表2。

表2 素皮鸭中分离出的各菌株形态特征Table 2 The morphological characteristics of strains isolated from fried and marinated bean curd stick

3.1.2 生理生化实验分析

根据《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰细菌鉴定手册》，通过油镜观察的菌体形态、革兰氏染色情况等，结合表3的生理生化实验结果，初步鉴定：X1为芽孢杆菌，X2为肠杆菌，X3为假单胞菌，X4为乳酸菌，X5为葡萄球菌。

表3 素皮鸭中各类菌种的生理生化实验结果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains from fried and marinated bean curd stick

注：+表示阳性；-表示阴性；/表示未实验。

3.2 素皮鸭的初始菌相构成

测定真空包装素皮鸭的细菌菌落数达2.8×105cfu/g，其初始菌落菌相构成见图1，素皮鸭样品的初始菌相以乳酸菌(39%)、假单胞菌(29%)和肠杆菌(24%)为主，其次为球菌(5%)和酵母菌(3%)。

图1 素皮鸭初始菌相构成Fig.1 Original bacterial flora composition of fried and marinated bean curd stick

3.3 素皮鸭保藏过程中各类菌群的变化

真空包装的素皮鸭成品在4 ℃保藏过程中各类菌群的变化见图2。

图2 素皮鸭4 ℃保藏过程中各类菌群变化Fig.2 The changes of several microbial flora in the process of vacuum-packed fried and marinated bean curd stick stored at 4 ℃

由图2可知，在4 ℃冷藏条件下，真空包装素皮鸭中乳酸菌、假单胞菌占主导地位，成品最终因乳酸菌、假单胞菌和肠杆菌的大量增长而腐败变质。

保藏7天中，乳酸菌一直平稳增长，最终成为保藏期间的优势菌，可能由于乳酸菌不断产乳酸、醋酸等酸性代谢产物，导致真空包装素皮鸭腐败变质后有酸败味。保藏前2天，假单胞菌缓慢生长，但从第4天开始呈增长趋势，最终成为真空包装素皮鸭的第二大优势菌。Raats D等[6]研究真空包装的豆腐于3 ℃贮藏，其主要优势菌为乳酸菌和假单胞菌，这和本实验的研究结果一致。

肠杆菌虽然增殖缓慢，但仍属第三大优势菌，其来源可能是生产环境和生产过程及生产操作人员等。球菌和酵母菌在整个菌相分析过程中，虽然可以测定但两者含量较低，尤其在腐败终点时，两者含量均呈最低值。在保藏前4天，酵母菌一直稳定增长，当第4天达到最高值，第5天开始逐渐下降。球菌在保藏前2天内，仍有增长趋势，但第3天开始逐渐平稳下降，最终认定球菌和酵母菌不能成为优势腐败菌。

4 讨论

本实验从真空包装素皮鸭中分离出5株菌种，经菌体特征、菌落形态、生理生化实验分析，初步鉴定：1株芽孢杆菌,1株肠杆菌，1株假单胞菌，1株乳酸杆，1株葡萄球菌。另本实验中将营养琼脂平板涂布菌液后于厌氧条件下培养，结果表明平板上无细菌生长，说明此菌为好氧或兼性厌氧，结合菌体特征、菌落形态、生理生化实验结果，初步判断素皮鸭中可能带有芽孢杆菌，彭玲慧等[7]在真空包装的卤豆干胀袋后，分离鉴定出1株优势腐败菌为蜡样芽孢杆菌，与本实验结果较吻合。在4 ℃冷藏条件下，乳酸菌、假单胞菌和肠杆菌是主要的优势腐败菌，可为延长素皮鸭货架期提供研究基础。