发酵兔肉酱挥发性风味物质的研究

王东，丁德龙，李华

(1.常州旅游商贸高等职业技术学校，江苏 常州 213032；2.青岛酒店管理职业技术学院，山东 青岛 266100；3.扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225001)

在感官方面，肉制品的风味是决定其整体可接受性的一个重要因素。肉制品独特的风味，是由滋味活性成分和香味活性成分共同形成的。滋味成分一般为非挥发性物质，但香味成分几乎都是挥发性的。人们能否接受某种食品取决于其风味的优劣，而评价风味首先是其香味。因此，挥发性风味组分对食品总体风味的形成起着非常重要的作用。不同风味成分的阈值对食品的累积感官属性都有重要影响[1]。因此，分析检测发酵兔肉酱中的挥发性风味物质，可以得到有关发酵兔肉酱微生物学、酶学以及化学等方面的重要信息[2]。

1 材料与方法

1.1 原材料及菌种

菌种：植物乳杆菌L21、葡萄球菌C5；

原料：无土腥味野兔肉，由盐城市食为天野兔专业合作社提供；辅料：葡萄糖、蔗糖(A.R.级)；食盐、脱皮芝麻、香辣酱、豆豉，均为市售食品级。

1.2 主要仪器与设备

手动SPME进样器、复合式75 μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；TR-5MS石英毛细管柱、Trace DSQ II 气相色谱-质谱联用仪、Trace GC Ultra气相色谱仪 美国Thermo公司；HSX-250型恒温恒湿培养箱 上海福玛实验设备有限公司；SW-CJ-1F型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；YX280B型手提式压力蒸汽灭菌器 上海三申医疗器械有限公司；HH-8数显恒温水浴锅 常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

基本配方：兔肉、蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食盐2.5%、水12%、豆豉4%、脱皮芝麻2%、四川香辣酱4%。

制作方法：兔肉解冻→预处理→绞碎→拌料(加蔗糖、葡萄糖、食盐和水)→接种→发酵→拌料(加豆豉、芝麻和香辣酱)→真空包装(高温蒸煮袋)→灭菌→成品。

发酵剂菌液制备：对筛选菌株进行糖类发酵试验，采用生化反应管检验，通过观察菌株对各种糖的利用情况确定其属种。将待鉴定菌株接种于生物反应管后于30 ℃培养24 h，观察培养基的颜色是否变化，若变为黄色，则为阳性，表明可发酵该糖并产酸。

操作要点：①兔肉预处理：将冷冻兔肉置于室温下解冻约4 h，清洗，去筋膜，绞碎。②接种发酵：肉糜中加入蔗糖、葡萄糖、食盐和水，混匀，添加发酵剂，再混匀搅拌。③发酵：密封，避光，于适宜条件下发酵。④拌料：发酵完成后，添加豆豉、芝麻和香辣酱等调味制酱。⑤包装灭菌：将发酵成熟的兔肉放入耐高温的包装袋中，真空包装，封口，高压锅121 ℃灭菌20 min，同时起到熟化肉酱的作用。

1.3.2 挥发性风味物质的提取

参照Pignoli G等[3]的方法，采用静态顶空固相微萃取(SPME)法提取风味物质中的挥发性风味成分。

称取20.0 g样品，室温下迅速均匀切碎后，置于萃取瓶内，锡纸封口，封口膜密封。复合式75 μm CAR/PDMS萃取头使用前先在气相色谱进样口(250 ℃)老化20 min，插入密封的萃取瓶，萃取纤维头探伸至样品上部的顶空中，在60 ℃水浴条件下吸附40 min，以备进样，进行GC-MS分析。

1.3.3 挥发性物质的鉴定

将萃取头插入进样口(250 ℃)解吸2 min，抽回纤维头后拔出萃取头，启动仪器进行分析检测。

气相色谱条件：色谱柱为TR-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为N2，流速为1 mL/min，进样口温度保持在250 ℃，以不分流方式进样。程序升温条件：起始温度40 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min的速度升温至130 ℃，8 ℃/min的速度升温至200 ℃，12 ℃/min的速度升温至250 ℃，保持7 min。质谱条件：离子源为EI源，能量为70 eV，温度为200 ℃；接口温度为250 ℃；检测器电压为350 V；发射电流为150 μA；扫描范围为33～500 amu。

1.3.4 图谱分析

定性分析：经GC-MS分析，根据标准图谱库NIST Library中的数据，对各色谱峰的质谱图进行人工分析和检索，对物质进行定性，确定挥发性成分。

定量分析：各挥发性风味物质的相对含量用其在图谱中对应的峰面积和峰面积百分比例表示。

2 结果与分析

2.1 兔肉酱发酵前后挥发性风味物质的比较

发酵前后样品中挥发性风味化合物总离子流色谱图见图1和图2。

图1 兔肉酱发酵前挥发性风味物质气相色谱图Fig.1 Gas chromatogram of flavor components in unfermented rabbit meat paste

图2 兔肉酱发酵后挥发性风味物质气相色谱图Fig.2 Gas chromatogram of flavor components in fermented rabbit meat paste

对未发酵兔肉酱和发酵兔肉酱的风味物质进行分析比较，相对峰面积≥0.2%的挥发性风味物质见表1。

表1 发酵前后兔肉酱的风味成分分析Table 1 Flavor components analysis of rabbit meat paste before and after fermentation

续 表

本试验对接种复合发酵剂发酵的兔肉酱和未发酵的对照样品进行挥发性风味成分的检测和分析。由表1可知，发酵组样品中共检测出相对峰面积≥0.2%的挥发性风味化合物48种，未发酵组样品中共检测出42种，这些挥发性成分主要是醇类、醛类、酸类、烃类、酮类、酯类、醚类和杂环类。

表2 样品中各类化合物相对百分含量Table 2 The relative percentage of compositions in samples

由表2可知，未发酵组中包括醇类7种，相对百分含量23.84%；醛类13种，相对百分含量25.43%；酸类3种，相对百分含量1.61%；烃类6种，相对百分含量3.44%；酮类4种，相对百分含量1.31%；酯类4种，相对百分含量1.90%；醚类3种，相对百分含量1.09%；杂环类化合物2种，相对百分含量7.42%。

发酵组样品中包括醇类7种，相对百分含量19.94%；醛类15种，相对百分含量24.68%；酸类4种，相对百分含量2.23%；烃类9种，相对百分含量5.87%；酮类5种，相对百分含量1.24%；酯类4种，相对百分含量2.48%；醚类2种，相对百分含量2.54%；杂环类化合物2种，相对百分含量9.75%。

可以看出，在未发酵和发酵组中都是醛类化合物的种类最多，其次是醇类和烃类。由于微生物发酵剂的作用，发酵组样品中相对含量在0.2%以上的挥发性风味物质种类发生了明显的变化，除了酯类、醚类和杂环类化合物之外，其他化合物的种类都有不同程度的增加。有研究表明，食品中蛋白质和脂质等物质都可以通过各分子间相互作用吸附风味化合物，从而影响风味化合物的释放，蛋白质和脂肪的含量也会影响挥发性化合物的风味强度[4,5]，温度也会影响蛋白质与风味化合物的吸附常数和结合位点[6]。

2.2 兔肉酱发酵前后主体风味物质成分分析

由表2可知，未发酵样品中醛类和醇类化合物是主要的风味物质，其次是杂环类化合物、烃类、酯类等。经过发酵，挥发性风味成分发生了变化，醛类仍是占比最大的一类化合物，其次是醇类、杂环类化合物和烃类，占有较大比重。在发酵过程中，部分醇类和醛类会被氧化，使醇类和醛类化合物的占比减少，而烃类和杂环类化合物的相对百分含量增加，变化较明显。从总体上看，发酵制品的风味得到了改善，主要的挥发性风味成分的百分含量也发生了改变。醛类化合物为发酵制品风味的主要贡献者，相对百分含量达到了24.68%，其次是醇类化合物(19.94%)、杂环类化合物(9.75%)和烃类化合物(5.87%)。

2.2.1 醇类化合物分析

在未发酵组和发酵组中最主要的醇类化合物都是戊醇，分别占比达到21.94%和17.66%，包括2-甲基环戊醇和3,4-二甲基-1-戊醇2种，共同检测到的醇类物质还有2-甲基-5-甲基乙烯基-环己醇。在未发酵组中检测到一定量的1-辛烯-3-醇、二氢香芹醇、反,反-2,5-十二碳二烯-1-醇，而发酵组中未检测到，说明经过发酵和加温过程后，可能化合物间发生了化学反应，导致发酵组中未检测出。在发酵组中检测到苯基乙醇、2-辛烯-1-醇、2-亚硝基-2-庚醇、2,4-癸二烯-1-醇，而未发酵组中却没有，表明这几种化合物可能是在发酵过程中产生的。

2.2.2 醛类化合物分析

肉制品中的醛类化合物一般是原料中固有或酯类经氧化分解生成的，醛类是阈值相对较低的化合物，因此也是肉类风味物质的重要贡献者。发酵组和未发酵组中共同检测到的醛类物质包括壬醛、辛醛、癸醛、十六醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2-壬烯醛、2-庚烯醛和苯甲醛这9种，发酵过程使得其中一些醛类物质减少，同时也出现了另外一些在未发酵组中检测不到的醛类。壬醛会呈现特别的脂味，辛醛一般具有清香味，庚醛具有腌肉的香味，2-庚烯酸会呈现油脂香味。而苯甲醛已被鉴定为烤花生的主要羰基化合物，具有令人愉悦的杏仁香、坚果香和水果香[7]。苯甲醛是由不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸氧化降解生成的各种小分子化合物形成[8]。由表1可推知，壬醛、2-辛烯醛和庚醛对未发酵兔肉的风味贡献较大，经过发酵处理以后，其相对百分含量大大减少，在发酵组中甚至未检出庚醛。发酵组挥发性风味物质中的主要醛类物质有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛。

2.2.3 酸类化合物分析

脂肪和磷脂的分解以及氨基酸的脱氨基作用可以产生酸类化合物，试验中共检测到酸类化合物5种，分别为环己基-1,4,5-三羟基-3-羰基-1-羧酸、十五烷酸、乙酸、壬酸、辛酸。只有乙酸在未发酵和发酵样品中都有检测到。乙酸带有刺激性气味，挥发性强，具有一定的酸味。未发酵样品中检测到3种酸类化合物，分别是环己基-1,4,5-三羟基-3-羰基-1-羧酸(0.70%)、十五烷酸(0.56%)、乙酸(0.35%)。发酵样品酸类化合物中十五烷酸(0.73%)和乙酸(0.69%)也占比较大，在发酵样品中还出现了壬酸和辛酸，占比分别达到0.48%和0.33%。

2.2.4 酮类化合物分析

酯类的分解或者醇类的氧化都可以生成酮类化合物，试验中检测到的酮类化合物共有8种，含量都不高。2-庚酮在2组样品中都有检测到，发酵后其占比有所下降。在未发酵组中占比最大的是环戊酮(0.39%)，发酵组中占比较大的是3-叔丁基-3-羟基苯甲酮(0.29%)和5-癸酮(0.33%)，此外，还检测到2,4-十二碳二烯-1-酮和3-羟基-2-丁酮，分别占比0.22%和0.20%。3-羟基-2-丁酮具有奶制品香味和油脂味。

2.2.5 酯类化合物分析

试验中共检测到酯类化合物7种，在2组样品中共同检测到的是9,12-十八碳二烯酸甲酯。乙酸乙酯在未发酵组酯类化合物中占比最大，达到0.75%。而发酵组样品中氨基甲酸甲酯和9,12-十八碳二烯酸甲酯的贡献较大，占比分别为0.74%和0.68%。此外，在发酵样品中还检测到一定的癸酸乙酯和辛酸乙酯。

2.2.6 其他化合物分析

碳氢化合物主要来源于脂肪酸烷基自由基的均裂。烃类化合物的阈值较高，所以对制品风味的贡献不显著。试验共检测到12种烃类化合物，其中，十三烷、正十五烷和2-三氟乙酰氧基十二烷是在2组样品中共同检测到的。在发酵组样品中检测出五甲基苯、苯并环庚三烯、1-亚甲基-1-氢-茚、1-甲基萘等在未发酵组中没有检测到的化合物。在未发酵组中，1-环丙基戊烷所占比重最大，为1.24%；在发酵组中，1-甲基萘所占比重最大，为1.52%。

杂环化合物的阈值较低，是肉品中重要的风味化合物，氨基酸和还原糖之间的美拉德反应可产生杂环类化合物及含氮含硫物质[9]。呋喃和吡嗪是美拉德反应的特征性产物，具有肉品的烘烤风味。在2组样品中都检测到含量较高的2-戊基呋喃，在未发酵组和发酵组中分别占比6.14%和9.38%。在发酵组样品中出现3-(1-环戊烯基)呋喃，占比为0.37%，这与研究发现的肉品风味中起作用的呋喃类物质基本一致。

3 小结

本试验用GC-MS方法对未发酵和发酵的兔肉酱样品中的挥发性风味物质进行检测和分析，共检测出相对峰面积≥0.2%的挥发性风味化合物68种。

发酵样品中检测出48种，包括醇类7种、醛类15种、酸类4种、烃类9种、酮类5种、酯类4种、醚类2种、杂环类化合物2种，其中醇类占19.94%，醛类占24.68%，酸类占2.23%，烃类占5.87%，酮类占1.24%，酯类占2.48%，醚类占2.54%，杂环类化合物占9.75%；未发酵样品中检测出42种，包括醇类7种、醛类13种、酸类3种、烃类6种、酮类4种、酯类4种、醚类3种、杂环类化合物2种，其中，醇类占23.84%，醛类占25.43%，酸类占1.61%，烃类占3.44%，酮类占1.31%，酯类占1.90%，醚类占1.09%，杂环类化合物占7.42%。

微生物发酵剂的作用使发酵样品中相对含量在0.2%以上的挥发性风味物质种类或含量发生了显著的变化，除了酯类、醚类和杂环类化合物之外，其他化合物的种类都有不同程度的增加，表明发酵剂对兔肉酱风味的改善有明显效果。

在未发酵组和发酵组中最主要的醇类化合物都是戊醇，分别占比21.94%和17.66%，共同检测到的醇类物质还有2-甲基-5-甲基乙烯基-环己醇；共有的醛类化合物有9种，但相对含量发生了显著变化。发酵组中的主要醛类物质有己醛糖、壬醛、十六醛、辛醛、2,4-庚二烯醛、2-十一碳烯醛、2-辛烯醛、2-癸烯醛、2,4-十碳二烯醛和苯甲醛；酸类、酮类、酯类的种类和占比都比较少；烃类的种类较多，但对风味的影响不显著；2组样品中都检测到含量较高的杂环类化合物2-戊基呋喃，在发酵组样品中检测到3-(1-环戊烯基)呋喃。