重组产气荚膜梭菌ε毒素三点突变体的融合表达及其免疫活性分析

杜吉革，张秀坤，朱 真，薛 麒，李启红，印春生，彭小兵，王 磊，姚文生，康 凯，陈小云

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原，其主要致病因子是其分泌的外毒素，能引起人和动物发病[1]。其中，ETX是该菌所有外毒素中毒力最强的毒素，能够引起动物的坏死性肠炎或者肠毒血症，导致感染动物在很短的时间内死亡，从而使抗生素治疗失去意义[2]。为此，ETX的疫苗免疫是防制其所致疾病的主要手段。然而，传统ETX的类毒素疫苗仍存在一定的缺点和安全隐患[2]。因此，无毒的ETX，对于开发ETX基因工程亚单位疫苗，及以其作为抗原组分的多价亚单位疫苗的研究和应用显得尤为重要。

ETX主要是由B型和D型产气荚膜梭菌产生，属于成孔毒素家族。已有的研究证实，组氨酸残基是影响ETX蛋白活性的关键性氨基酸，而第106位的组氨酸突变为脯氨酸的重组ETX基本是无毒的，然而该重组突变体的可溶性表达比例较低(小于5%)，不利于后续的大量生产和纯化[2]。此外，姚文武[3]研究发现，第196位氨基酸突变后能够明显降低ETX毒力。在亚单位疫苗的研制中，增加Th细胞表位和佐剂能够提高疫苗的免疫原性。已有的研究表明，口蹄疫病毒VP4蛋白的第20-35位氨基酸是一种良好的Th细胞表位[4]。作为一种应用较为广泛的免疫佐剂，细菌的鞭毛蛋白(flagellin)主要是通过其高度保守的N端和C端来激动TLR-5受体，从而诱发机体产生更强的体液免疫与细胞免疫应答[5]。本研究利用基因合成技术，在对ETX编码基因进行密码子优化的同时，引入了3个氨基酸位点突变：Y30A、Y196A以及H106Y，从而降低了因单个氨基酸突变在未来基因工程疫苗大规模生产中可能造成的生物安全隐患。同时，引入VP4蛋白的Th细胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸(FN)的编码序列，通过原核系统表达并纯化重组蛋白，并对其毒力和免疫原性进行了研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料 D型产气荚膜梭菌C60-2株、D型产气荚膜梭菌C60-2株天然毒素、兔源D型产气荚膜梭菌抗血清以及pET30a-(+)表达载体均为本实验室保存；1.5～2.0 kg普通级健康日本大耳白兔和16～18 g ICR小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；pEASY-Blunt Cloning Vector、感受态细胞Top10和BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；Montanide ISA 201佐剂购自法国赛彼科(seppic)公司；Ni-IDA亲和层析介质试剂盒、蛋白Marker、Western blot Marker、蛋白溶解液(50 mmol/L Tris-HCl, 10% Glycerol, 150 mmol/L NaCl, pH8.0)，均购自南京金斯瑞生物科技有限公司; 高保真PCR酶(KFX-401S)购自东洋坊公司；premix Taq version 2.0、DNA Marker购自Takara公司。T4 DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒购自Promaga公司；限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ购自NEB公司；抗His标签单抗、Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购自碧云天生物技术有限公司；明胶缓冲溶液，LB培养基购自北京中海生物科技有限公司。

1.2 基因合成及密码子优化 以D型产气荚膜梭菌C60-3株ETX编码基因为模版，按大肠杆菌偏爱的密码子进行了优化设计，并引入3个氨基酸点突变：第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸，第106位组氨酸突变为脯氨酸。此外，在突变基因5'端添加VP4蛋白的Th细胞表位和鞭毛蛋白N末端第84-101位氨基酸的编码序列，在突变基因3'端添加6*His标签蛋白编码序列。由中美泰和公司人工合成基因片段GTFNETXm3。

1.3 ETX突变体原核表达载体的构建 以GTFNETXm3基因为模板，采用引物对1F/1R进行PCR扩增。其中上游引物1F序列为：5'-CGCCATATGAATAAAGTAAAATGT -3'，其5'端引入限制性内切酶NdeⅠ位点(下划线部分)及保护性碱基；下游引物1R序列为：5'-CCGAAGCTTTTAGTGGTGATG，其5'端引入限制性内切酶HindⅢ位点(下划线部分)及保护性碱基。PCR体系为50 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；98 ℃变性10 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸90 s，共33个循环；最后68 ℃延伸7 min。扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/HindⅢ双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a(+)载体连接。将连接好的质粒转化Top10感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37 ℃振荡培养过夜，提取质粒进行PCR和双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的质粒送中美泰和公司测序，将测序正确的质粒命名为pET30a- GTFNETXm3。

1.4 重组蛋白的表达与鉴定 将质粒pET30a-GTFNETXm3转化BL21(DE3)感受态细胞，分别在15 ℃和37 ℃条件下用IPTG诱导表达，收集菌体，超声破碎后分别收集上清和沉淀，采用SDS-PAGE检测重组蛋白的表达情况及其可溶性，将表达的目的蛋白称为rTFNETXm3。采用Western blot方法，以抗His标签蛋白抗体为一抗，对重组蛋白做进一步的鉴定。

1.5 重组蛋白的纯化与鉴定 按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对以包涵体形式表达的目的蛋白进行纯化，用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，-80 ℃保存备用。采用Western blot方法检测纯化蛋白与D型产气荚膜梭菌抗血清的反应性[2]。

1.6 重组蛋白的毒力测定[2]采用MDCK细胞检测rTFNETXm3的细胞毒性；采用ICR小鼠检测rTFNETXm3的小鼠毒性。

1.7 免疫原性分析[2]以纯化的rTFNETXm3免疫日本大耳白兔，采用血清中和的方法测定兔血清的毒素中和效价；二免后21 d，用1个MLD的D型产气荚膜梭菌天然毒素进行攻毒，判定试验疫苗的免疫保护效力。

2 结 果

2.1 ETX突变体原核表达载体的构建 采用引物1F/1R进行PCR扩增，扩增片段经酶切后克隆至pET-30a(+)载体上。获得的重组质粒经双酶切后电泳观察，结果如图1所示。酶切后出现大小约5 kb的载体DNA片段，以及大小约1290 bp的目的基因片段，与预期相符。测序结果表明，插入的外源基因序列是正确的。将此重组质粒命名为pET30a-GTFNETXm3。

2.2 ETX突变体的原核表达鉴定 将重组表达质粒pET30a-GTFNETXm3转化至BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示，表达的目的蛋白分子量约为51 kDa，大小与预期相符。BL21(DE3)菌体在15 ℃诱导表达16 h后，rTFNETXm3具有较高比例的可溶性表达，而在37 ℃诱导表达4 h后，rTFNETXm3主要以包涵体的形式表达(图2a)。图2b为重组蛋白的Western blot鉴定结果，如图所示，表达的目的蛋白能与抗His标签抗体发生反应，证明目的蛋白含有His标签，与预期相符。综合考虑重组蛋白的表达量及诱导时间等条件，确定目的蛋白最适诱导表达条件为37 ℃，诱导表达4 h，收获裂解后的沉淀蛋白，用于后续的纯化。

1：DL5000 DNA相对分子质量标准; 2：重组质粒pET30a-GTFNETXm3的NdeⅠ和HindⅢ双酶切鉴定1：DL5000 DNA marker; 2： pET30a-GTFNETXm3 digested with NdeⅠand HindⅢ

a：重组蛋白表达的SDS-PAGE鉴定；b：重组蛋白与抗His单抗的Western blot M1：蛋白Marker；M2：Western blot Marker；PC1：BSA (1 μg)；PC2：BSA (2 μg)；NC.未诱导细胞裂解物；1：15 ℃ 16 h诱导的细胞裂解物；2：37 ℃ 4 h诱导的细胞裂解物；NC1：未诱导细胞裂解上清；NC2：未诱导细胞裂解沉淀；3：15 ℃ 16 h诱导的细胞裂解上清；4：15 ℃ 16 h诱导的细胞裂解沉淀；5：37 ℃ 4 h诱导的细胞裂解上清；6：37 ℃ 4 h诱导的细胞裂解沉淀a：The identification of recombinant protein expression by SDS-PAGE; b：The identification of recombinant protein with anti-His monoclonal antibody by Western blot M1：protein marker; M2：Western blot marker；PC1：BSA (1 μg) ; PC2：BSA (2 μg); NC：The cell lysates without induction; 1：The cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 2：The cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃;NC1：The supernatant of cell lysates without induction; NC2：The precipitation of cell lysates without induction; 3.The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃; 4：The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 16 h at 15 ℃;5：The supernatant of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃; 6：The precipitation of cell lysates induced with IPTG for 4 h at 37 ℃

2.3 ETX突变体的纯化与鉴定 如图3所示，按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒说明书对以包涵体形式表达的rTFNETXm3进行纯化，收集纯度较高的Lane 7～12洗脱液进行透析和复性，最终获得的蛋白浓度为1.03 mg/mL。将纯化后的rTFNETXm3经SDS-PAGE电泳后转印到PVDF膜上进行Western blot检测。结果显示，rTFNETXm3能够与D型产气荚膜梭菌抗血清反应(图4)。

M1:蛋白Marker; 1:包涵体溶解离心后上清；2:清与Ni-IDA 孵育后流出液；3-4: 50 mmol/L Imidazole的洗脱液；5: 100 mmol/L Imidazole的洗脱液；6-11:500 mmol/L Imidazole的洗脱液M1:protein Marker; 1:The supernatant of dissolved inclusion bodies;2:The flow-through from Ni-IDA resin after incubated with supernatant;3-4:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer(contain 50 mmol/L Imidazole); 5:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 100 mmol/L Imidazole);6-11:The elution from Ni-IDA resin washed with elution buffer (contain 500 mmol/L Imidazole)

M：蛋白Marker；1.未诱导的细胞裂解物；2：纯化后的rTFNETXm3M:Protein Marker;1:The cell lysates without induction;2:rTFNETXm3 after purification

2.4 rTFNETXm3的毒力测定

2.4.1 对MDCK细胞的毒力测定 MDCK细胞加入各组分后继续培养24 h，显微镜下观察。1000倍稀释的天然D型产气荚膜梭菌毒素接种细胞组出现了明显的细胞病变，多数细胞崩解(图5a)；接种浓度为100 μg/mL、10 μg/mL rTFNETXm3蛋白的实验组(图5b)、接种肉肝胃酶消化汤和洗脱液的阴性对照组及空白对照组细胞均生长良好，未出现细胞病变(图5c)。

2.4.2 rTFNETXm3对小鼠的毒力测定 经过胰酶活化的rTFNETXm3，分别10 μg/只及100 μg/只的剂量尾静脉注射小鼠，结果rTFNETXm3注射组及肉肝胃酶消化汤注射组小鼠，在注射后24 h均存活，未见任何异常。注射1个MLD天然毒素的小鼠，在注射后24 h内全部死亡。以上结果说明rTFNETXm3已成功减毒，即使经过胰酶活化后，在本实验注射剂量范围内，对小鼠依然是无毒的。

2.5 ETX突变体的免疫原性分析

2.5.1 血清毒素中和抗体效价的测定 如表1所示，经血清中和法测定，以rTFNETXm3制备疫苗免疫家兔后，每毫升的一免抗血清可中和80～120个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素；每毫升的二免抗血清可中和750～1100个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素，而佐剂对照组的兔血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用。以上结果表明，rTFNETXm3的免疫效力远高于现行《中华人民共和国兽药典》的规定标准，是优良的制苗用候选抗原。

2.5.2 攻毒保护性试验 在二免后21 d，对所有rTFNETXm3免疫组和佐剂免疫对照组的家兔，经耳缘静脉注射1个MLD的D型产气荚膜梭菌天然毒素进行攻毒，结果显示：佐剂免疫对照组家兔在攻毒后5 d内全部死亡，rTFNETXm3免疫组家兔全部健活，未见任何不良反应，保护率达100%。

3 讨 论

ETX属于成孔毒素家族，在结构上主要分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ三个区域，分别在毒素与细胞受体结合过程、与细胞受体结合稳定性的维持以及细胞膜穿孔的形成过程中发挥着重要作用[6]。由于毒素中有2条35个氨基酸的肽链同时跨过Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ三个区域[7]，导致仅使用毒素的一个域作为疫苗候选抗原的策略(如α、β毒素的C末端[8-9])很难应用于该毒素的防控。在无毒重组ETX亚单位疫苗的研究中，经典的无细胞毒性的突变体为第106位组氨酸突变为脯氨酸的ETX重组蛋白，其安全性和免疫原性已经得到大量验证[10-11]。虽然该突变体蛋白可溶性较低，但由于考虑到以包涵体形式表达的蛋白可能缺乏正确的空间构象，导致研究者通常选择表达水平较低的可溶蛋白[6, 12]，而以包涵体形式表达的毒素突变体的活性以及免疫原性尚未见报道。

a: 加入1000倍稀释的天然毒素培养液后培养24h的细胞；b1-b2:分别加入浓度100 μg/mL以及10 μg/mL的rTFNETXm3培养液后 培养24 h的细胞；c1:蛋白洗脱液对照；c2:用于培养D型产期荚膜梭菌的肉肝胃酶消化汤对照；c3: 细胞培养基对照a: MDCK cell cultured with the toxin-containing medium of Clostridium perfringens type D with dilution 1000 for 24 h；b1-b2:MDCK cell cultured with rTFNETXm3-containing medium with concentrate of 100 μg/mL and 10 μg/mL, respectively, for 24 h;c1:MDCK cell cultured with elution buffer control; c2: MDCK cell cultured with anaerobic beef, liver and stomach digestive enzyme soup used by Clostridium perfringens type D; c3: Cell culture control

rTFNETXm3是在37 ℃诱导4 h获得的以包涵体形式表达的重组蛋白，对MDCK细胞以及小鼠在检测范围内均未表现出毒性，与已有的文献报道的突变体毒力测定结果相符[3]。而rTFNETXm3一免兔血清每毫升可中和80 MLD以上，二免兔血清每毫升可中和750 MLD以上，效果明显优于目前的商品化疫苗标准(30 MLD)[13]，说明以包涵体形式表达的rTFNETXm3经纯化复性后具有良好的免疫原性。与可溶性表达的蛋白纯化过程相比，以包涵体形式表达的重组蛋白在纯化中可最大程度的降低蛋白中内毒素的含量，更适用于大规模兽用疫苗的制备。