禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗安全性、最小免疫剂量及免疫效力试验

王 红，曹 志，毛娅卿，吴 涛，宋新宇，宫 晓，张 恒，马 爽，李慧姣，范根成*

(1. 青岛易邦生物工程有限公司 动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266114；2. 中国兽医药品监察所，北京 100081)

禽脑脊髓炎(Avian Encephalomyelitis, AE)又称流行性震颤，是由禽脑脊髓炎病毒(AEV)引起的一种主要危害4周龄以下雏鸡，以侵害中枢神经系统引起非化脓性脑炎为主要病理特征的病毒性传染病[1-3]。种鸡群发病期间及发病前后各1个月内所产种蛋，导致孵化率降低并引起子代雏鸡带毒发病[4-5]。该病现已遍布世界各地，在我国流行日趋严重，但尚无有效的治疗药物，预防主要依靠疫苗免疫[6]，疫苗主要有弱毒活疫苗和灭活疫苗两种[7-8]。目前，国内无活疫苗，只有灭活疫苗，但生产厂家未生产和供应，且2007年停止了进口苗注册，故市场上急需疫苗免疫，禽脑脊髓炎相关疫苗的研发非常必要。

鸡痘(Avian Pox, AP)是由鸡痘病毒引起鸡和火鸡的一种疾病，特征是体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶(皮肤型)，或上呼吸道、口腔和食管黏膜出现纤维性坏死和增生性病灶(白喉型)，也可能同时发生全身性感染[9-10]。世界各地已广泛流行，目前国内只有鸡痘活疫苗产品用于预防。

鉴于禽脑脊髓炎、鸡痘活疫苗的免疫日龄相似，免疫途径一致，且国外已有同类产品注册上市，试验利用有自主知识产权的种毒禽脑脊髓炎YBF02株和鸡痘鹌鹑化弱毒株研制成活疫苗，并进一步对该疫苗的安全性、最小免疫剂量和免疫效力进行了研究，以期为该疫苗生产和检验技术参数的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 用禽脑脊髓炎YBF02株和鸡痘鹌鹑化弱毒株毒种，自制3批禽脑脊髓炎、鸡痘二联活疫苗(以下简称“疫苗”)，批号分别为2012001、2012002、2012003。

1.1.2 攻毒用强毒 禽脑脊髓炎强毒VR株、鸡痘强毒102株，均由中国兽医药品监察所冻干鉴定。

1.1.3 SPF鸡胚、鸡 SPF种蛋购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，部分孵化至6日龄(SPF鸡胚)用于实验，部分孵化至出壳(SPF鸡)，饲养于负压隔离器内。

1.2 方法

1.2.1 疫苗的安全性试验 将40只21日龄SPF鸡随机分为4组，10只/组，用于2012001、2012002、2012003批疫苗进行安全性试验。将各批次疫苗均按瓶签注明羽份用灭菌PBS适当稀释后，经刺种途径接种SPF鸡，10羽份/只(10倍使用剂量)。最后10只不接种作为空白对照。接种后28 d内观察所有鸡的精神、食欲、生长发育是否正常，28 d时进行称重，并剖检观察有无病理变化。

1.2.2 疫苗最小免疫剂量测定

1.2.2.1 AEV YBF02株的最小免疫剂量 取40只21日龄SPF鸡随机分为4组，每组10只。1～3组，分别刺种25 EID50、50 EID50、100 EID50的AEV YBF02株；第4组不免疫作对照。免疫后21 d，4组试验鸡每只脑内注射AE强毒VR株0.1 mL(含104.0EID50/只)。攻毒后连续观察21 d，记录各组发病情况，计算保护率，确定AEV YBF02株的最小免疫剂量。

1.2.2.2 鸡痘鹌鹑化弱毒株的最小免疫剂量 取40只21日龄SPF鸡随机分为4组，每组10只。1～3组，分别刺种5 EID50、10 EID50、20 EID50的鸡痘鹌鹑化弱毒株；第4组不免疫作对照。免疫后观察6 d，统计各组痘肿率；免疫后21 d，4组试验鸡每只腿部毛囊涂抹鸡痘强毒102株(含100个最小发痘量)。攻毒后连续观察14 d，记录各组病变情况，计算保护率，确定鸡痘鹌鹑化弱毒株的最小免疫剂量。

1.2.2.3 判定标准

1.2.2.3.1 禽脑脊髓炎雏鸡临床症状 以下症状出现任何一项均判为发病。(1)精神沉郁、反应迟钝、缩脖；(2)喜卧，驱赶时共济失调，偶尔见头颈部出现不同程度的震颤；(3)站立困难，斜坐在跗部；(4)瘫痪或死亡。

1.2.2.3.2 鸡痘临床病变表现 涂抹毛囊开始红肿、增厚，后变黄白色干酪样物，结血痂等融合全经过型。

1.2.3 疫苗的免疫效力试验

1.2.3.1 病毒含量测定

1.2.3.1.1 AEV含量测定 将疫苗用灭菌PBS稀释至1羽份/0.2 mL，取5 mL在2～8 ℃条件下以12000 g离心15 min；上清液经0.22 μm滤器过滤1次，0.10 μm滤器过滤2次；取滤液再继续作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-43个稀释度，分别卵黄囊接种10枚6日龄SPF鸡胚各10枚，每胚0.2 mL，另取10枚同批次SPF鸡胚不接种作对照。37 ℃孵育(48 h内死亡者弃去不计)至正常出雏日的3 d后，统计其未出壳胚数、特异性死亡雏数及有禽脑脊髓炎特异性临床症状的雏鸡数，计算EID50。对照组应至少8枚正常出雏，且均无禽脑脊髓炎的特异性临床症状。

1.2.3.1.2 APV含量测定 将疫苗用灭菌PBS稀释至1羽份/0.2 mL，再继续作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-43个稀释度，经绒毛尿囊膜分别接种11～12日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.2 mL，置37℃孵育96～120 h时，鸡胚绒毛尿囊膜水肿增厚或出现痘斑判为感染，计算EID50。

1.2.3.2 攻毒保护试验 将3批疫苗分别用灭菌PBS适当稀释后，每批疫苗各免疫21～35日龄SPF鸡20只，每只于翅内侧无血管处皮下刺种疫苗1羽份，另取20只SPF鸡不免疫作对照，分别隔离饲养。

1.2.3.2.1 疫苗对AEV的免疫效力评价 免疫后21 d，免疫组和对照组各随机取10只鸡，每只脑内注射禽脑脊髓炎强毒VR株0.1 mL(含104.0EID50)，观察21 d，观察期间未出现“1.2.2.3.1”判定标准中禽脑脊髓炎雏鸡临床症状的判为免疫保护，计算免疫组保护指数(protective index, PI)。免疫组PI计算方法为攻毒对照组鸡产生病变百分数减去免疫组鸡产生病变百分数，再除以攻毒对照组鸡产生病变百分数，乘以100；攻毒对照鸡的保护率不计算。

1.2.3.2.2 疫苗对APV的免疫效力评价 免疫后21 d，免疫组和对照组各随机取10只，每只鸡各腿部毛囊涂抹鸡痘强毒102株0.1 mL(含100个最小发痘量)，观察14 d，观察期间未出现“1.2.2.3.2”判定标准中鸡痘临床病变表现的判为免疫保护，计算免疫组PI。

2 结 果

2.1 疫苗的安全性 所有试验鸡均未发生禽脑脊髓炎、鸡痘，刺种部位均出现痘肿(鸡痘免疫成功的标志)，精神食欲、生长发育均正常；各免疫组与对照组的体重无明显差异；剖检所有试验鸡脏器均未见异常(表1)。

表1 疫苗的安全性试验结果Tab 1 Safety of the combined AE and AP live vaccine

2.2 疫苗的最小免疫剂量 结果见表2、表3。从表2可知，AEV YBF02株以100 EID50刺种免疫21日龄SPF鸡后，攻毒保护率为100%；对照组90%发病。从表3可知，鸡痘鹌鹑化弱毒株以10 EID50和5 EID50分别刺种免疫21日龄SPF鸡后，痘肿率分别为10/10和7/10；攻毒保护率分别为100%和70%；对照组100%鸡痘病变。以上试验结果说明，AEV YBF02株免疫100 EID50即能达到100%保护，鸡痘鹌鹑化弱毒株免疫10 EID50即能达到100%保护。所以AEV YBF02株的最小免疫剂量为100 EID50，鸡痘鹌鹑化弱毒株的最小免疫剂量为10 EID50。

表2 疫苗AEV YBF02株最小免疫剂量Tab 2 The minimum immune dose of the AEV (YBF02 Strain) of the vaccine

表3 疫苗鸡痘鹌鹑化弱毒株最小免疫剂量Tab 3 The minimum immune dose of the APV (Quail-Adapted Strain) of the vaccine

2.3 疫苗的免疫效力

2.3.1 病毒含量测定 由表4可知，各批疫苗中AEV YBF02株病毒含量均≥103.2EID50/羽份，鸡痘鹌鹑化弱毒株的病毒含量均≥103.4EID50/羽份。

2.3.2 疫苗攻毒保护试验结果 由表5可知，3批疫苗各刺种免疫21～35日龄SPF鸡，免疫后21 d进行攻毒：脑内攻击AE强毒VR株的免疫组PI为89～100，空白对照组80%～90%发病；腿部毛囊涂抹鸡痘强毒102株的免疫组PI均为100，空白对照组100%鸡痘病变。

表4 疫苗病毒含量测定结果Tab 4 The virus content of the combined live vaccine

表5 疫苗免疫攻毒试验结果Tab 5 The result of the tested chickens challenged with AEV VR strain and APV 102 strain

3 讨论与小结

AEV YBF02株是自行分离鉴定的一株具有高度免疫原性和嗜肠型的疫苗毒株，仅对1日龄SPF鸡大剂量刺种可引起约10%发病，并可通过粪便排毒，对疫苗的安全性产生影响[11]。本试验中疫苗的安全性试验结果表明，疫苗对21日龄SPF鸡通过刺种途径接种10倍使用剂量是安全的。此外，有研究表明，21日龄及以上鸡免疫系统发育已经健全，免疫功能正常时，能够很快产生免疫应答，攻毒保护试验结果证明了这一点。且该日龄段鸡较易获得，饲养成本也相对较低，同时对禽脑脊髓炎和鸡痘均易感。因此，建议在实际疫苗检验时采用21～35日龄作为疫苗的检验用SPF鸡日龄。

由疫苗的最小免疫剂量和病毒含量测定结果可知，3批疫苗AEV YBF02株的病毒含量为最小免疫剂量的15倍以上，鸡痘鹌鹑化弱毒株的病毒含量为最小免疫剂量的250倍以上，所以疫苗中的病毒含量应能保证免疫鸡产生足够的免疫效力。

APV不同剂量免疫后鸡痘痘肿率和攻毒保护结果显示，免疫10 EID50达到10/10的痘肿率和10/10攻毒保护率；免疫5 EID50达到7/10痘肿率和7/10攻毒保护率。上述结果说明，疫苗免疫后鸡痘痘肿率和攻毒保护具有很好的相关性。考虑到生物安全和检验工作方便，可以用鸡痘痘肿法替代免疫攻毒法进行鸡痘鹌鹑化弱毒株的效力检验。

疫苗攻毒保护试验中2012002批疫苗AE免疫组，攻毒后10只鸡中有1只发病，免疫保护9/10。虽然试验理论接种剂量为1羽份/只，超过最小免疫剂量多倍，但是整个免疫攻毒保护试验过程中，可能会受到鸡个体差异、进入鸡体内有效免疫剂量、强毒株的有效攻毒剂量和试验操作等因素的影响，导致免疫组中个别鸡没有达到理想的免疫效果。这种现象在试验中是可能存在的，此试验数据将会为制定疫苗效力检验判定标准提供依据。