改进Dische比色法测定海带中的岩藻聚糖含量

黄桂华，叶静，肖美添，张学勤，张娜

(华侨大学 化工学院，福建 厦门，361021)

海带是一种常见的重要大型经济海藻，在我国分布广泛，产量约占世界总产量的95%，常作为食品，又是重要的医药工业原料。迄今为止，已从海带中提取多种多糖，主要包括岩藻聚糖、褐藻胶、褐藻淀粉[1]，三者主要存在于海带细胞壁间及细胞质中[2-3]，化学组成不同。

岩藻聚糖，又称褐藻糖的硫酸多糖或褐藻聚糖，是海带中所固有的细胞间水溶性杂多糖，在海带中的含量为0.3%～1.5%。从海带中提取的岩藻聚糖主要成分为L-岩藻糖及硫酸基，还含少量单糖，主要有甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖等，其化学结构受海带收获季节、生长环境及海带品种的影响较大[4]。岩藻聚糖是海带中特效生理活性成分，主要有抗炎、抗肿瘤、降血脂、抗氧化、抗肝损伤及抗病毒等生理活性[5-10]，还可开发作为乳化剂使用[11]。而分子链末端的硫酸基和L-岩藻糖是影响其生理活性的最重要因子。L-岩藻糖可通过抑制K562细胞增殖起到抗肿瘤作用[12]，并且其抗肿瘤活性还与糖代谢产物密切联系[13]，由于岩藻聚糖结构复杂，并非单一结构的化合物，主要是通过测定其主要成分L-岩藻糖的含量对其进行定量分析。

目前缺乏标准的岩藻聚糖含量的检测方法，常用的定量方法有Dische比色法、高效液相色谱法、气相色谱法、CAMERON法[14]。其中Dische法简便、准确，安全可靠且分析成本低，无需昂贵仪器。但存在显色反应时间过长，分析速度较慢的缺点。本文对Dische比色法进行改进，并用于测定不同地区不同收获季节的12种海带中岩藻聚糖含量。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

海带，产自福建霞浦、泉港、连江和山东荣成等地区；L-半胱氨酸盐酸盐，国药集团化学试剂有限公司；L-岩藻糖，上海麦克林生化科技有限公司；岩藻聚糖样品，青岛明月海藻集团有限公司；体积分数95%乙醇、浓H2SO4均为分析纯。

UV-1800紫外可见分光光度计，上海美普达仪器有限公司；DK-S11型电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；BSA124S电子分析天平，赛多利斯科学仪器有限公司；THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器，北京博医实验仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Dische比色法测定L-岩藻糖的含量

Dische法测定L-岩藻糖含量的实验原理见文献[15]其操作步骤为：

标准溶液配制：配制0.1 mg/mL的L-岩藻糖标准液，并逐级稀释成质量浓度为10、20、30、40、50、60、70、80 μg/mL的L-岩藻糖标准溶液。置于4 ℃冰箱中备用。

标准曲线制作：分别移取1 mL上述不同质量浓度的标准溶液及空白液于25 mL的具塞玻璃试管，冰水浴中加入4.5 mL体积分数87%的H2SO4溶液，摇匀于冰浴中放置1 min，置于室温下几分钟后，使溶液回升至室温，在沸水浴中加热10 min，室温中加入3%的L-半胱氨酸盐酸盐溶液0.1 mL，室温下静置4 h，分别测定396 nm和427 nm的吸光度A396及A427，以A396-A427为纵坐标，作标准曲线。

考察振荡，温度，L-半胱氨酸盐酸盐添加量对显色反应的影响，确定最佳条件。

1.2.2 不同地区12种海带岩藻聚糖含量的测定

原料预处理：将来自不同海域的干海带清洗干净后粉碎，过200目的筛网，分别称取30 g，在240 mL 95%乙醇下回流3 h，进行脱色脱脂及除去海带中的甘露醇。过滤，将回流得到的海带粉于40 ℃恒温烘干。

岩藻聚糖提取工艺：取预处理过的干燥海带粉5 g于250 mL的烧杯中，加入200 mL的蒸馏水，在70℃下恒温浸提5 h，过滤。加入0.25倍的质量分数10%CaCl2溶液以除去滤液中的褐藻胶，静置、过滤，将滤液减压浓缩至一定体积，加入95%的乙醇至体积分数为60%乙醇溶液，使岩藻聚糖沉淀，离心收集沉淀，冷冻干燥至恒量，即为岩藻聚糖粗品。

褐藻糖胶含量测定：采用改进的Dische比色法测定海带中L-岩藻糖，分别配制质量浓度为200 μg/mL的来自不同地区海带中提取得到的岩藻聚糖样品溶液。按标准曲线操作方法测其吸光度。计算来自不同地区海带中L-岩藻糖的含量。

2 结果与分析

2.1 改进的Dische比色法的建立

2.1.1 振荡对显色稳定性的影响

振荡条件对显色稳定性的影响如图1所示。

图1 振荡条件对显色稳定性的影响Fig.1 Shaking conditions effect on the color stability

如图1所示，分别考察了在振荡及静置条件下吸光度随时间的变化，岩藻聚糖质量浓度为60 μg/mL时，振荡条件下，在3 h时吸光度基本不变，显色达到稳定，静置条件下，显色稳定需要4 h。由于振荡条件加速液体流动，因此加速了L-半胱氨酸盐酸盐与L-岩藻糖的反应，使其在较短的时间内反应完全，达到显色稳定。低浓度下反应完全的时间比高浓度下短，显色更快速达到稳定。

2.1.2 温度对显色稳定性的影响

分别考察岩藻聚糖质量浓度为30、80 μg/mL温度对显色稳定性的影响，见图2。在室温下静置，显色稳定需要4 h，在40 ℃下静置时，显色在1 h时基本达到稳定，升高温度可缩短反应稳定的时间，由于加热促进L-岩藻糖与半胱氨酸盐酸盐的反应。继续升高温度，当温度为60 ℃时，吸光度值随时间的变化下降，可能是温度过高，破坏L-半胱氨酸盐酸盐与L-岩藻糖反应得到的产物，导致颜色褪色，从而吸光度值减小。因此反应选择最适宜的温度为40 ℃。

图2 温度对显色稳定性的影响Fig.2 Temperature effect on the color stability

2.1.3L-半胱氨酸盐酸盐添加量对显色稳定性的影响

图3为L-半胱氨酸盐酸盐添加量对显色稳定时间的影响。分别加入0.1、0.2、0.3 mL的L-半胱氨酸盐酸盐于1 mL浓度为80 μg/mL的标准L-岩藻糖溶液中，1、2、3、4、5 h时测定其吸光度，考察显色的稳定性。采用传统的Dische比色法，添加0.1 mL的L-半胱氨酸盐酸盐，显色稳定时间为4 h。增加L-半胱氨酸盐添加量，大大缩短了显色反应时间，由于反应物L-半胱氨酸盐酸盐的增加，加快其与L-岩藻糖的显色反应，缩短了显色稳定时间。

图3 L-半胱氨酸盐添加量对显色稳定性的影响Fig.3 L- cysteine hydrochloride effect on the color stability

2.1.4 方法的确定

图4和图5分别为改进的Dische法及Dische比色法对显色反应时间的影响。图4为改进的Dische法，在振荡条件下，温度40 ℃，L-半胱氨酸盐酸盐添加量0.2 mL的条件下，显色反应约40 min达到稳定，由图5可知，采用传统Dische法进行操作，其显色稳定时间需要4 h。由结果可知，改进的Dische比色法对L-岩藻糖进行测定，大大缩短了显色稳定时间，提高测定方法的效率。

图4 改进的Dische法吸光度随时间的变化Fig.4 Variation of absorbance with time using the modified Dische colorimetric method

图5 Dische法吸光度随时间的变化Fig.5 Variation of absorbance with time in Dische colorimetric method

2.1.5L-岩藻糖标准工作曲线

采用改进Dische法操作的方法，冷却至室温后加入3%的半胱氨酸盐酸盐溶液0.2 mL，混匀后，置于40 ℃，160 r/min的恒温振荡器中振荡，40 min后测其吸光度，得到标准曲线如下。

图6 L-岩藻聚糖标准工作曲线Fig.6 L-fucose standard work curve

由图6中所绘制的标准曲线中可知：吸光度A与L-岩藻糖溶液浓度C的关系式：A= 0.015 99C-0.027 82，其相关系数R2= 0.998，结果说明在一定的范围内L-岩藻糖质量浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2.2 方法学的考察

2.2.1 重复性考察

准确吸取6份质量浓度为80 μg/mL的样品溶液1 mL各置于25 mL的具塞试管中，按改进的Dische比色法测定吸光度。实验结果见表1，相对标准偏差为1.96%，表明改进Dische法重复性良好。

表1 重复性实验结果Table 2 Results of reproducibility experiment

2.2.2 中间精密度考察

准确吸取6份质量浓度为80 μg/mL的样品溶液1 mL各置于25 mL的具塞试管中，分别由2个分析人员使用不同的仪器及试剂，按改进的Dische比色法测定吸光度。实验结果见表2，相对标准偏差为1.68%，表明改进Dische法精密度良好。

2.2.3 显色稳定性考察

精确吸取1 mL样品溶液于25 mL的具塞试管中，按改进的Dische比色法的操作步骤，当显色稳定后，每隔30 min记录1次吸光度值，考察显色的稳定性。结果见表3，在5 h内，样品溶液吸光度值变化不大，RSD为0.64%，显色体系在5 h内保持稳定。

表2 精密度实验结果Table 2 Results of precision experiment

表3 显色稳定性考察实验结果Table 3 Experimental results of color stability

2.2.3 加标回收率考察

准确配置80 μg/mL的样品溶液，精确量取1 mL于25 mL的具塞试管中，分别加入50、60、70、80 μg的标准品，按改进的Dische法测定其吸光度，计算L-岩藻糖标准品的回收率。结果表明，海带岩藻聚糖的回收率在97.16%～105.13%，符合相关规定。

表4 加标回收率的测定结果Table 4 Results of spiked standard recoveries

2.3 不同海域海带岩藻聚糖的含量测定

表5 不同海域海带岩藻聚糖含量的测定Table 5 The contents of fucoidan in different Laminaria japonica

岩藻聚糖的生理特性与L-岩藻糖含量、硫酸根含量及位置、分子质量等因素密切相关[14]。由于岩藻聚糖的结构受多种因素如物种、生长年限、生长地点的不同而差异较大，由表4可知深海海带中岩藻聚糖含量比近海高，养殖周期在后期的海带中岩藻聚糖含量高于前期海带。三者比较，福建霞浦的含量最高。

3 结论

(1)采用改进的Dische比色法测定岩藻聚糖，在振荡条件，温度40 ℃，L-半胱氨酸盐酸盐添加量为0.2 mL时，大大缩短了分析时间，其精密度高，显色稳定，加样回收率高，标准工作曲线线性相关度高，R2=0.998，为后续试验的数据准确性奠定了基础。

(2)不同地区不同海域或生长周期不同的海带，岩藻聚糖含量不同。其中来自深海、养殖周期在中后期的海带岩藻聚糖含量较高。霞浦深海，养殖周期在中期的海带中岩藻聚糖含量最高，达到1.05%。