植物乳杆菌dy-1发酵草菇泡菜工艺研究

王强，孙鑫娟，程珂，肖香，董英

(江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江，212013)

草菇[Volvariellavolvacea(Bull.exFr.)Sing.]别名南华菇、美味苞脚菇、兰花菇、麻菇及中国菇等，主要分布于热带和亚热带地区[1]，是典型的高温型食用菌。草菇肉质肥嫩，味道鲜美，并富含蛋白质、氨基酸、VC及磷、钾、钙等多种营养物质，经常食用具有降低胆固醇和预防高血压、冠心病的作用[2-4]。

我国草菇的食用方式一直以鲜食为主，但草菇后熟作用强烈，采摘后极易出现褐变、老熟、软化及自溶液化腐败等现象[5]。尽管朱东红等[6]和JIA等[7]学者对草菇保鲜进行了许多研究，但产业化应用还有一定难度。NOVIANTI 等[8]对草菇进行真空冷冻干燥后虽易于贮藏，便于流通，但由于其能耗多，价格高，仍难以完全解决草菇供求之间的矛盾。

本研究以草菇为原料，采用植物乳杆菌dy-1(Lactobacillusplantarumdy-1)为发酵菌株，建立直投式乳酸菌发酵草菇泡菜工艺，并以自然发酵作为对照进行对比分析。

1 材料和方法

1.1 试验材料与菌种

草菇：江苏江南生物科技有限公司提供；食盐和蔗糖(食用级)：购于超市；柠檬酸(食用级)：购于江苏国信协联能源有限公司；氯化钙(食用级)：购于江苏科伦多食品配料有限公司。

植物乳杆菌(Lactobacillusplantarumdy-1；菌株编号：CGMCCNo.601)：由江苏大学食品营养与安全实验室自行分离与制备。

1.2 培养基与试剂

乳酸菌活化与技术培养基：MRS培养基。

NaOH:分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酚酞：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.3 仪器与设备

电子天平，上海精科天平仪器厂；电磁炉，九阳股份有限公司；TA-XT2i质构分析仪，英国Stable Micro System有限公司；YTC-2000型打孔器，江苏省江都市麾村医教仪器厂；Color Quest XE型分光测色仪，美国Hunter Lab公司；PHS-3TC型酸度计，上海天达仪器有限公司；SPX-250B-G型微电脑光照培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；全自动灭菌锅，上海三申医疗器械有限公司；无菌操作台，苏州净化设备有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 菌种活化

将保藏的植物乳杆菌dy-1的菌种按1∶10体积比接种于液体MRS培养基中，置于36 ℃恒温培养箱中进行10 h的第1次活化，将第1次活化菌液按1∶5体积比接种于液体MRS培养基中，置于36 ℃恒温培养箱中进行14 h的第2次活化后备用。

1.4.2 草菇泡菜发酵工艺流程

1.4.3 草菇泡菜烫漂工艺条件的优化

选择柠檬酸质量浓度(1、2、3 g/L)、CaCl2质量浓度(6、8、10 g/L)、食盐质量浓度(8、10、12 g/L)、烫漂时间(5、7、9 min)进行L9(34)正交试验，取样测定草菇脆度和色差，确定烫漂的最佳工艺参数。

1.4.4 草菇泡菜发酵工艺优化

1.4.4.1 食盐质量浓度选择

分别添加20、30、40、50、60 g/L的食盐，在植物乳杆菌接种量为5%，蔗糖添加量为20 g/L，置于23 ℃培养箱中发酵5 d，并对发酵草菇进行总酸含量测定及感官评价，研究食盐质量浓度对草菇泡菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.4.2 蔗糖质量浓度选择

分别添加0、10、20、30、40 g/L的蔗糖，在植物乳杆菌接种量为5%，食盐添加量为40 g/L，置于23 ℃培养箱中发酵5 d，并对发酵草菇进行总酸含量测定及感官评价，研究蔗糖质量浓度对草菇泡菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.4.3 植物乳杆菌接种量选择

分别接种2%、3%、4%、5%、6%的植物乳杆菌，在食盐添加量为40 g/L，蔗糖添加量为20 g/L，置于23 ℃培养箱中发酵5 d，并对发酵草菇进行总酸含量测定及感官评价，研究植物乳杆菌接种量对草菇泡菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.4.4 发酵温度选择

按照草菇泡菜发酵工艺流程，在食盐质量浓度为40 g/L，蔗糖质量浓度为20 g/L，植物乳杆菌接种量为5%的条件下，分别在温度为15、19、23、27、31 ℃的培养箱发酵5 d，并对发酵草菇进行总酸含量测定及感官评价，研究发酵温度对草菇泡菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.4.5 TPA测定方法

参照文献[9]的方法制备样品：草菇经打孔器、制取φ1 cm×1 cm的圆柱体；探头选用：平板圆柱探头(φ25 mm)；试验参数设定：测试速率、测后速率均设定为1.0 mm/s，压缩量1.5 mm，2次压缩间隔时间3 s。

1.4.5 草菇泡菜发酵工艺正交试验设计

选取食盐质量浓度(A)、蔗糖质量浓度(B)、植物乳杆菌接种量(C)、发酵温度(D)单因素中较优的发酵条件设计正交试验因素水平表，在此基础上，以总酸和感官评分作为评定指标，采取L9(34)正交试验来确定最优的发酵工艺。采用多指标正交试验的变异系数分析方法对总酸和感官评分2个指标进行计算得出综合评定值。

1.4.6 优化直投发酵工艺与自然发酵草菇泡菜品质比较

按照上述正交试验得出的草菇泡菜最佳发酵工艺参数，以自然发酵为对照，比较其草菇泡菜理化、微生物和感官指标差异。

1.4.7 理化指标和微生物指标的测定

pH值的测定：采用精密pH计直接测定。总酸的测定：参照GB/T 12456—2008采用酸碱中和滴定法测定。亚硝酸盐测定：参照GB 5009.33—2010 采用盐酸萘乙二胺法测定。菌落总数计数：参照GB 4789.2—2010 方法测定。乳酸菌数计数：参照GB 4789.35—2016 方法测定。酵母菌和霉菌计数：参照GB 4789.15—2010方法测定。大肠菌群计数：参照GB/T 4789.38—2008方法测定。

1.4.8 感官评价方法

将成熟草菇泡菜(含酸量0.5%～0.8%为成熟标准)样品放置在一次性纸盘中，邀请10名经过专业感官评价训练的评审员组成评定小组对泡菜的色泽、气味、滋味、质地进行感官评定[10-11]，评价标准见表1。

表1 草菇泡菜感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of Volvariella volvacea pickles

1.4.9 数据处理

采用Excle 2010统计处理数据制作表格，OriginPro 9.0作图。应用SPSS 22.0软件对数据进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 草菇泡菜烫漂工艺条件的优化

如表2所示，影响草菇泡菜烫漂工艺因素的顺序为：柠檬酸质量浓度>氯化钙质量浓度>食盐质量浓度>烫漂时间。对烫漂工艺过程的综合评定主要是针对烫漂后草菇的硬度和色差2个指标，参照胡庆国[12]方法按各指标权重系数与各指标试验测试值的隶属函数值乘积作为最终综合评定值。其中氯化钙质量浓度、食盐质量浓度和烫漂时间为显著性因素，柠檬酸质量浓度为极显著性因素。烫漂时加入氯化钙和柠檬酸可以改善产品质地，提高产品的脆性、弹性和咀嚼性，保持其自然色泽[13-15]，根据各因素对烫漂后草菇硬度和色泽的影响结果，确定草菇烫漂的工艺参数为：柠檬酸2 g/L，氯化钙6 g/L，食盐10 g/L，烫漂时间9 min。

表2 草菇泡菜烫漂工艺正交试验结果Table 2 The orthogonal experiment result of blanching process

2.2 食盐质量浓度对产酸量和感官评价的影响

图1 食盐质量浓度对草菇发酵产酸量的影响Fig.1 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different salty concentration

食盐添加量会影响发酵过程中微生物的生长代谢及泡菜口味，从而影响泡菜风味[16]。由图1和表3可知，随着食盐质量浓度的增大，总酸含量逐渐降低，主要是由于渗透压的原因，植物乳杆菌的生长受到抑制，草菇泡菜发酵速度减慢，成熟时间延长。在20～40 g/L的食盐质量浓度下，发酵所对应的泡菜总酸差异不显著(p>0.05)，50 g/L的食盐已经开始影响泡菜产酸量，经过显著性分析，在发酵5 d时，其感官评价结果(82.8分)差异显著(p<0.05)。较低质量浓度食盐条件下草菇泡菜的气味和滋味较差，可能是由于草菇泡菜酸味较重，咸味不足。而食盐质量浓度过高，泡菜咸味太重，影响口感。在食盐添加量为40 g/L时，草菇泡菜总酸含量为0.78 g/100 g，感官评分最高为86.2分，因此，选择食盐40 g/L为最佳。

表3 不同食盐质量浓度下草菇泡菜感官评分Table 3 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different salty concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

2.3 蔗糖浓度对产酸量和感官评价的影响

图2 蔗糖质量浓度对草菇发酵产酸量的影响Fig.2 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different sucrose concentration

由图2可见，蔗糖作为植物乳杆菌的碳源，在发酵的起始阶段可有效促进植物乳杆菌的生长，并随着蔗糖质量浓度的增大，总酸含量增加，成熟时间缩短。蔗糖添加量在30 g/L和40 g/L时，在第2天已达到成熟(总酸含量0.59 g/100g和0.62 g/100g)，在泡菜生产过程中加入适量蔗糖，可以提高发酵速度，缩短生产周期。在发酵后期，随着发酵速度减慢，添加蔗糖组泡菜总酸含量差异不显著(p>0.05)。

由表4可知，当蔗糖添加量为40 g/L时，其感官评分较低，为78.2分，这是因为蔗糖添加量较大时，泡菜过甜而掩盖了其他风味物质，使其香气和滋味较差，并且其泡菜水也较粘稠。在蔗糖添加量为20 g/L时，草菇泡菜感官评分最高为84.3分，此时草菇泡菜总酸含量为0.85 g/100 g。因此，结合草菇泡菜总酸和评价指标，添加20 g/L的蔗糖为最佳。

表4 不同蔗糖质量浓度下草菇泡菜感官评分Table 4 The score of Volvariella volvacea pickles sensory quality at different sucrose concentration

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

2.4 乳酸菌接种量对产酸量和感官评价的影响

由图3可知，植物乳杆菌接种量对泡菜总酸有很大影响，在发酵前期，产酸量与接种量成正相关。在发酵5 d后，接种量为5%的条件下草菇泡菜总酸含量最高为0.90 g/100 g，接种量6%时草菇泡菜总酸含量则有所降低，主要源于乳酸菌添加量过多时，其自身生长需要消耗大量的糖，却减少了乳酸的生成[17]。

由表5对草菇泡菜感官评分可知，在乳酸菌接种量为5%时，草菇泡菜评分最高为80.3分，与乳酸菌接种量在4%时感官评分(79.0分)差异不显著(p>0.05)，乳酸菌接种量太高会造成泡菜香气与滋味较差，从而影响泡菜的感官品质[18]。因此，选择4%乳酸菌接种量较为合适。

图3 植物乳杆菌接种量对草菇发酵产酸量的影响Fig.3 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different inoculation amount of Lactobacillus plantarum

菌接种量/%色泽(20分)气味(20分)滋味(30分)质地(30分)总分214.4±0.71a12.5±0.85a22.9±0.57b24.2±0.63a74.0±0.94a315.6±0.97bc13.2±1.32a23.8±0.63c24.1±0.74a76.7±2.67b415.3±0.95abc14.8±0.92b24.0±0.67c24.9±0.54b79.0±1.83c516.0±1.25c14.9±0.57b24.4±0.52c25.0±0.67b80.3±1.64c615.0±0.82ab14.2±0.92b22.3±0.82a24.4±0.84ab75.9±1.29b

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

2.5 发酵温度对产酸量和感官评价的影响

由图4和表6可知，随着温度的升高，乳酸菌生长代谢加快，产酸量较高，在27和31 ℃下发酵时，泡菜总酸在2 d时就接近0.5 g/100 g，达到成熟。但温度较高条件下泡菜感官评分较低，可能是乳酸菌产酸较快，酸味太重，香气不浓，滋味较差[19]。在15和19 ℃条件下，乳酸菌活性受到抑制，生长缓慢，不利于总酸的生成。发酵草菇泡菜的感官评分随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势， 23 ℃时感官评分最高为81.9分，但在23 ℃(总酸含量0.68 g/100 g)与31 ℃(总酸含量0.70 g/100 g)温度范围内发酵草菇泡菜的总酸含量差异并不显著(p>0.05)。综合草菇泡菜总酸和感官评价指标，本研究发酵温度可选择23 ℃。

图4 发酵温度对草菇发酵产酸量的影响Fig.4 The change of Volvariella volvacea pickles total acid at different temperature

发酵温度/℃色泽(20分)气味(20分)滋味(30分)质地(30分)总分1514.4±0.97a13.2±0.79a22.9±0.88a23.2±0.79ab73.7±1.77a1914.9±0.74a13.6±0.84a24.5±0.85b23.8±0.63bc76.8±1.69b2316.5±0.85b15.1±0.88b25.6±0.73c24.7±1.16c81.9±1.45c2714.8±0.92a15.2±1.23b24.3±0.82b23.9±0.99bc78.2±1.62b3114.6±1.07a13.4±0.52a22.4±1.26a22.6±1.17a73.0±1.33a

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

2.6 正交试验结果与分析

通过上述单因素试验初步确定了各因素的最佳浓度，选取食盐质量浓度、蔗糖质量浓度、乳酸菌接种量和发酵温度作为正交试验的4个因素，采用L9(34)正交表进行优化，正交实验结果与分析见表7。影响草菇泡菜的因素顺序为：B>A>D>C，各因素最佳组合为A2B3C1D2。在该组合的工艺条件下，草菇泡菜的总酸为0.83 g/100 g，感官评分为87分，故确定草菇泡菜的最佳发酵工艺为：食盐40 g/L，蔗糖30 g/L，乳酸菌接种量4%，发酵温度23 ℃。方差分析结果表明蔗糖质量浓度对草菇泡菜的发酵有极其显著的影响(p<0.01)，食盐质量浓度和发酵温度对其有显著影响(p<0.05)。

表7 草菇泡菜发酵工艺优化正交试验结果Table 7 The orthogonal experiment results of fermentation Volvariella volvacea

2.7 植物乳杆菌发酵和自然发酵泡菜成品品质比较

由表8可知，植物乳杆菌直投发酵草菇泡菜发酵成熟周期比自然发酵较短，其亚硝酸盐含量明显低于自然发酵的草菇泡菜(p<0.05)，且远低于GB 2762—2017中亚硝酸盐含量的限量(20 mg/kg)，说明植物乳杆菌可以抑制亚硝酸盐的生成；植物乳杆菌直投发酵的草菇泡菜成品中霉菌 <10 CFU/g，大肠菌群 <30 CFU/g，符合GB 2714—2015的限量，而自然发酵草菇泡菜成品中霉菌和大肠菌群均超过国家食品安全标准的限量。由于在自然发酵中容易滋生杂菌，泡菜成熟后气味和滋味较差，其感官评分明显低于植物乳杆菌直投式发酵。

表8 植物乳杆菌发酵和自然发酵泡菜成品理化、微生物和感官指标Table 8 Physicochemical and microbial index, sensoryevaluation of Volvariella volvacea pickles with Lactobacillusplantarum and natural fermentation

注：同一列的不同字母表示在p<0.05水平差异显著。

3 结论

草菇中加入2 g/L的柠檬酸，6 g/L的氯化钙，10 g/L的食盐作为护色剂和保脆剂，时间为9 min的烫漂预处理可有效抑制草菇褐变，保持较好的色泽和脆度。在选定的试验参数范围内，食盐质量浓度，蔗糖质量浓度，植物乳杆菌接种量和发酵温度均对草菇泡菜发酵品质有影响，其中以蔗糖质量浓度对发酵草菇泡菜影响最大，其次为食盐质量浓度和发酵温度，乳酸菌接种量影响最小。草菇泡菜发酵的最佳工艺参数为：食盐质量浓度40 g/L，蔗糖添加量20 g/L，植物乳杆菌接种量4%，发酵温度23 ℃。由植物乳杆菌直投发酵制备的草菇泡菜中乳酸菌含量高于自然发酵，其霉菌数、大肠菌群数量和亚硝酸盐含量均远低于自然发酵，符合相关国标，食用更加安全，且成熟时间和感官品质均优于自然发酵，泡菜风味更加浓郁纯正。乳酸菌直投发酵草菇泡菜不仅能促进草菇深加工产业的发展，缓解草菇保鲜期短的压力，同时也为食用菌方便食品的开发提供新思路。